细胞株开发的关键一步– Minipool的筛选

在生物制药开发过程中，构建稳定的高产细胞株尤为重要，它将伴随药品的整个生命周期，并直接决定了药品的开发成本、生产效率与产品质量。细胞株开发（Cell line development，CLD）作为生物药开发的起点与基础，大致可以分为以下几个步骤，包括：宿主细胞系的选择，表达载体的构建，细胞转染，细胞筛选与评估等等，从而获得生长能力强、放大性好、稳定且高产的优质的单克隆细胞株，由此看出细胞株开发的重要性，因此通过诸多策略优化CLD是很多公司的重点工作。通过优化细胞株的筛选方法进行CLD的工艺优化，高效的筛选方法可以直接决定优质单克隆的形成与否。

那么，在获得一个优质的宿主细胞后，细胞筛选中的Minipool筛选对于整个细胞株开发流程也至关重要。Minipool筛选的目的是创建稳定表达的细胞池。由于每个池都会从小的初代细胞群开始，池与池之间自然会存在许多差异。通过筛选一系列不同的细胞池，从中选出较优的候选池，后续分离出高产量、稳定的单克隆概率就更高。

接下来我们将着重讨论Minipool铺板的密度对细胞筛选的影响。Minipool筛选时的细胞铺板密度会影响细胞的生长状态、代谢情况、恢复率，进而改变细胞的稳定性、蛋白表达量和质量。例如铺板密度过低会使细胞生长缓慢，并且大大降低恢复率，从而需要提高筛选通量，导致了实验人员工作量的增加，延长了筛选周期。但铺板密度过高可能会导致同一个细胞池中细胞的竞争和相互作用，破坏细胞的生长状态，以至于影响后续单克隆的质量。因此在Minipool筛选时，优化细胞铺板密度是必要的。通常来说，铺板密度的优化需要考虑到细胞株类型、细胞培养条件与生产工艺等多重因素。一个合适的铺板密度会提高单克隆的质量与稳定性，为生物药的开发提供保障。

本次实验使用电穿孔的方式对宿主细胞CHOZN^® GS^-/-进行转染，并在转染24小时后进行minipool铺板，使用EX-CELL^® CD CHO Fusion培养基，EX-CELL^® CHO Cloning培养基。选取的96孔板铺板密度分别为：7500细胞/孔（200μL/孔）、5000细胞/孔（200μL/孔）、2500细胞/孔（200μL/孔）、1000细胞/孔（200μL/孔）。实验结果显示，使用7500细胞/孔的密度铺板，细胞拥有最好的恢复率为94.4%。在密度1000细胞/孔到7500细胞/孔的范围内，细胞恢复率随着铺板密度的降低而下降。

对于细胞表达情况来说，在96孔板中，7500细胞/孔与5000细胞/孔都拥有良好的表现，7500细胞/孔的平均表达量略高于5000细胞/孔，表达量超过30mg/L的数量7500细胞/孔略高于5000细胞/孔。5000细胞/孔的铺板密度最高表达量高于7500细胞/孔，达到了76.5mg/L。

图1. 细胞表达情况

因此，我们选择铺板密度5000细胞/孔，细胞表达量排名前24的Minipool进行扩培，使用EX-CELL^® Advanced™ CHO基础培养基和EX-CELL^® Advanced™ CHO Feed1补料培养基，在摇管中进行Fed-batch，结果如下：

图2. 表达量Top24的Minipool

有83%的Minipool在D14的表达量超过1000mg/L，最高的Minipool表达量大于3000mg/L。统计数据表格如下：

表2. 表达量Top24的Minipool

综上所述，对于CHOZN^®细胞株，Minipool可以选择相对较高的铺板密度（7500细胞/孔或5000细胞/孔）。考虑到恢复率和最高表达，推荐Minipool铺板密度为5000细胞/孔，可以使细胞株开发过程更高效并且节约一定的成本。