项目文章 | 枸杞碳点通过METTL3/Clip3轴介导的m6A修饰抑制辐射诱导的骨损伤

放射治疗是头颈部恶性肿瘤的标准治疗方法。骨放射性坏死(ORN)是放射治疗后最严重的不良事件之一，对于难治性晚期ORN需进行颌骨根治性切除及微血管骨肌皮游离皮瓣重建，目前尚无治疗放射性骨损伤的有效药物。

枸杞是中国著名的传统中草药。一些研究报道，枸杞及其提取物具有抗衰老作用，并可抵抗辐射引起的骨损伤。中草药中最有效的成分是生物大分子，而生物大分子的细胞摄取效果较差。纳米技术是克服这些缺陷的有效方法。中药碳点（CDs）具有良好的生物相容性、高表面积体积比和纳米级尺寸等特点，可促进细胞内摄取和药物渗入病变组织。因此，利用枸杞合成的CDs可能对辐射性骨损伤有治疗作用。

Result1 枸杞CDs的合成与表征

本研究采用水热法从枸杞中制备CDs(图1a)。高分辨率透射电镜(HRTEM)图像显示，CDs分散良好，形状均匀，无明显聚集(图1b)，直径3.5 nm，晶格间距0.32 nm。CDs水溶液在日光下呈棕色，在紫外光下呈蓝色(图1c)。

图1. CDs的合成与表征

Result2  CDs可减弱辐射损伤，延缓细胞衰老

研究人员将骨髓间充质干细胞(BMSCs)分为四个组：对照组（BMSCs）、8 Gy辐射组（BMSCs+radiation）、预防组（BMSCs+CDs）和治疗组（BMSCs+radiation+CDs）。

首先，作者做了一系列体外功能实验，其中CCK-8、凋亡分析和细胞周期分析证明CDs可减弱由辐射诱导的BMSCs的损伤(图2c-e，h，i)；Transwell实验及CFU测定表明CDs能显著促进辐照细胞的迁移和繁殖(图2f-k，j)。

细胞衰老在许多辐射引起的损伤和骨病中起着关键作用，研究人员探讨了CDs是否可以抑制辐射诱导的BMSCs的衰老。β-半乳糖苷酶染色结果显示CDs显著降低了辐射诱导的衰老、CDKN1A和CDKN2A是典型的衰老标记，通过qPCR和WB结果均能证明其表达水平降低，由此证明CDs可以抑制辐射诱导BMSCs的衰老。

图2. CDs可减弱辐射诱导的BMSCs损伤和衰老

Result3 CDs促进辐照后BMSCs成骨分化，抑制成脂分化

研究表明，辐射促进成脂分化和抑制成骨分化。因此研究人员评估了CDs对体外辐照BMSCs成骨和成脂分化平衡的影响，发现CDs增加了辐照BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性(图3a,b)。茜素红染色结果显示，与对照组相比，辐射降低了BMSCs的矿化，而CDs可以逆转这种抑制作用(图3c)。qPCR和WB同时表明CDs促进照射后BMSCs成骨(图3f，d)。同时，油红O染色检测和qPCR结果分别显示CDs减少了BMSCs的成脂分化，减少了成脂标记基因Lpl、Pparg和Fab-4的表达(图3e、g)。综上，CDs促进辐照后BMSCs的成骨分化，抑制其成脂分化。

图3. CDs在照射后调节成骨和脂肪生成平衡

Result4 CDs预防ORN发生并促进体内骨整合

作者用动物实验来验证CDs的治疗效果，放疗后拔下颌第一磨牙建立ORN大鼠模型，对大鼠实施安乐死，并收集下颌骨进行后续分析（图4a）。显微ct和组织学检查显示，CDs可预防大鼠放射性骨坏死的发生（图4）。同时，在胫骨中植入钛种植体，苏木精、伊红(H&E)和SA-β-gal染色显示表明CDs能促进辐照骨的骨整合，暴露于CDs的胫骨内钛植入物周围的骨形成增强(图4)。即，CDs可以抑制ORN的发生，促进种植体周围的成骨。

图4.CDs可预防大鼠骨质疏松，促进钛种植体骨整合

Result5 CDs可调控m6A介导的表观转录组学

为了探究CDs的内在调控机制，作者检测了CDs处理后不同对比组间的m6A水平。结果显示，CDs显著上调了总RNA的m6A水平。因此，作者提出CDs可能通过m6A修饰对辐射引起的损伤发挥治疗作用(图5)。对辐照的BMSCs和经CDs处理的BMSCs进行了RNA-seq和MeRIP-seq，并对两项测序结果进行GO、KEGG功能富集分析：生物信息学表明差异甲基化峰的功能注释在RNA降解中显著富集，因此在随后的实验中作者重点研究了高甲基化但下调的基因。

图5. RNA-seq联合MeRIP-seq分析

Result6 CDs通过METTL3/Clip3轴减弱辐射诱导的细胞衰老

为了进一步探索CDs介导的m6A修饰，作者检测了引起m6A修饰的相关酶的表达水平，qPCR结合WB结果显示，CDs显著增加了Mettl3在BMSCs 中的表达水平(图6b，c)。此外，m6A“writer”的结合位点RRACH在每组的m6 A位点内都高度富集，表明修饰高度活跃(图6d)。

近期研究表明，Clip3的下调可抗辐射引起的损伤。MeRIP-seq显示，具有高甲基化峰的Clip3被CDs下调(图5i)。qPCR和WB显示，CDs降低了辐照BMSCs 中Clip3的表达(图6e,f)。即，METTL3与Clip3的表达呈负相关。为了进一步研究Clip3在辐射诱导的细胞衰老中的作用，作者使用siRNA敲降了Clip3，β-半乳糖苷酶染色结果证实Clip3的下调可抑制细胞衰老。

综上所述，CDs通过促进METTL3表达，导致m6 A修饰增加，从而导致Clip3 mRNA转录物的降解(图6a)，进而减弱因辐射诱导所产生的骨损伤。

图6. CDs通过METTL3/Clip3轴减弱辐射诱导的细胞衰老

本研究利用水热法从枸杞中合成了CDs。CDs具有良好的生物相容性，研究表明CDs可通过抑制细胞衰老来预防辐射所致的骨损伤，同时保护大鼠免受ORN的影响，并促进体内钛植入物周围的成骨。此外，CDs通过促进METTL3上调，导致m6 A修饰增加，从而导致Clip3 mRNA转录物的降解。

综上所述，来自宁夏枸杞的CDs通过METTL3/Clip3轴以m6A依赖的方式减弱辐射诱导的骨损伤，本研究为辐射诱导的骨损伤的治疗提供了新的见解。

【参考文献】

Guo, Zhiyong; Wang, Zilin; Liu, Yige; Wu, Hao; Zhang, Qiaoyu; Han, Jing; et al. (1753): Carbon Dots from Lycium barbarum Attenuate Radiation-Induced Bone Injury by Inhibiting Senescence via METTL3/Clip3 in an m6A‑Dependent Manner. ACS Publications. Collection. https://doi.org/10.1021/acsami.3c01322

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排版人：小久

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