染料探针 | 具有水溶性和光稳定性的激活型肾清除探针利用生物标志物对急性肾损伤进行NIR-II荧光和光声检测

2023-05-25 18:16:20, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：急性肾损伤(AKI)具有严重的短期或长期并发症，发病率和死亡率高，对健康构成极大威胁。开发高性能的NIR-II探针，通过NIR-II荧光和光声双模成像实现AKI的无创原位检测具有重要意义。然而，NIR-II发色团通常具有大共轭性和疏水性，这使得它们无法被肾脏清除，限制了它们在肾脏疾病的检测和成像中的应用。本文研制了一种具有肾脏清除、水溶性和被激活生物标志物且具有良好光稳定性等特点的探针（PEG3-HC-PB）。该探针的荧光(900 – 1200 nm)由于具有吸电子作用的苯硼基团(响应元件)的存在而猝灭，在830 nm处有一个微弱的吸收峰。但在AKI的肾区存在过表达的H2O2的情况下，苯硼基团被转化为苯羟基，从而增强了NIR-II荧光发射(900−1200 nm)和吸收(600−900 nm)，最终产生明显的光声信号和可用于成像的NIR-II荧光发射。该探针能够通过对生物标记物H2O2的响应，使用实时3D-MSOT和NIR-II荧光双模成像技术检测造影剂诱导的和缺血/再灌注诱导的小鼠AKI。因此，该探针可以作为检测AKI的实用工具；此外，它的设计策略可以为其他具有多种生物学应用的大共轭NIR-II探针的设计提供借鉴。

背景：急性肾损伤通常有严重的短期或长期并发症，发病率和死亡率高，如果不及时治疗，甚至可能成为危及生命的疾病。AKI的准时监测对于及时采取行动防止其发展为更严重的并发症，包括高血压、急性肺水肿、心律失常和慢性肾脏疾病等至关重要。目前，在医学实践中，特定的生物标记物常被用来筛查亚临床疾病和诊断特定的疾病，因为这些生物标记物在相关疾病的部位经常以异常高的水平过度表达。一些生物标志物不仅存在于疾病部位，而且还存在于其他器官和/或组织中，而一些生物标志物(例如，活性氧(ROS))寿命短，因此在疾病部位对特定生物标志物的非侵入性原位检测/成像，有望成为准确诊断特定疾病以及揭示与疾病相关的发病机制的理想方法。

近红外第二窗口(NIR-II，900-1700 nm发射)的荧光成像具有固有的优势，即组织中的光线散射较弱，自发荧光很少，因此可以以更高的分辨率和更深入的方式实时成像，有助于更准确地诊断疾病和了解疾病的进展。光声成像方法通过收集样品中的光吸收剂产生的超声波，对穿透深度大和分辨率高的样品进行成像。尤其是，多光谱光声层析成像(MSOT)通过采用多波长的激光照射样品来检测样品中不同光吸收剂产生的超声信号；并且通过光谱分解来确定每个光吸收剂的光谱特征，从而可以跟踪特定光吸收体的光声信号。同时，其3D(三维)图像可以很容易地获取或生成，从而促进疾病部位的准确定位和对其大小的评估。适合NIR-II荧光和光声双模成像的探针是非常有用的，因为它提供的信息可以相互验证。在肾损伤部位，包括H2O2在内的ROS水平升高，导致氧化应激增强，相应地导致组织损伤增加，炎症加重。肾损伤部位的内源性H2O2可能是一种有前景的原位生物标志物。因此，利用可以进行NIR-II荧光成像和光声成像的探针，对AKI进行无创性的原位检测，是准确定位AKI的理想方法。

然而，由于肾脏滤过阈值小于6 - 8nm(肾小球滤过屏障)，要达到肾脏可清除的程度，物质必须足够小，没有不适当的蛋白质结合导致大聚集体或颗粒。足够的水溶性有助于减少或避免与蛋白质的结合。因此环糊精或聚乙二醇(n=3−45，聚乙二醇)等亲水基团常常用于对一些发色团(或探针)的修饰，使其在近红外第一窗口发射(近红外-I，700−900发射)或可见光范围(Vis，400−700 nm发射)可用于肾脏成像。由于这些NIR-I或Vis发色团(探针)的共轭长度相对较短，因此它们在被亲水性基团修饰后通常不会与蛋白质显著结合。相比之下，用于制备NIR-II成像探针的NIR-II发色团通常具有长共轭和疏水性的结构。这种结构往往导致较差的水溶性，在水生物环境中容易聚集成大颗粒，以及其与蛋白质的非特异性结合，阻碍了这些生色团在肾脏中的清除。由此，为了确保成像探针是肾脏清除的，从而可以用来有效地检测和成像，探针最好是水溶的，尺寸小于6−8 nm。

七甲基花菁类染料是一类重要的近红外发色团，其较易于进行结构修饰以将其荧光拓展到NIR-II波段，且吸收系数高。但它们的长共轭结构和疏水性通常造成其无法被肾脏清除，从而限制了它们在肾脏疾病检测和成像中的应用。过去的研究试图通过在染料的两端引入亲水基团来改善这些染料的水溶性，但并不一定会使它们变成肾脏清除。例如，已被FDA批准用于临床应用的吲哚青绿(ICG)是水溶性的，因为接合结构的两侧都引入了亲水磺酸基，但它仍然是被肝脏清除，而不是被肾脏清除；这是因为中间的结合骨架仍然疏水，很容易与体内的蛋白质结合，导致形成的颗粒太大而不能被肾脏清除；采用PEGn(n=3−45)作为亲水性基团也是如此，如方案1A所示。

为了充分发挥七甲基菁染料的优点，同时克服其相对较差的光稳定性，开发一种可用于检测和成像AKI的NIR-II荧光和光声双模成像探针，本研究设计了具有肾脏清除、水溶性和生物标志物可激活且具有良好光稳定性的PEG3-HC-PB探针。该探针的设计策略包括以下三个方面：(1)在两端和中间引入三个亲水和生物相容的PEG3基团(方案1B)，将疏水的共轭骨架分段，从而确保水溶性，避免与蛋白质结合；(2)在中心环己烯基的底部和顶部分别引入叔丁基和酰胺基(方案1B)，导致空间位阻增加，共轭骨架的电子密度降低，防止染料因亲电攻击而光漂白；(3)将反应元件(苯基硼酸基)引入中心部分，开发了生物标志物可激活探针(PEG3-HC-PB)，用于H2O2原位反应NIR-II荧光和光声双模成像检测小鼠AKI(方案1B)。该探针的荧光(900−1200 nm，峰值位于950 nm)由于吸电子的苯硼基团的存在而被猝灭，在830 nm处有一个较弱的吸收峰。但在AKI的肾区存在过表达的H2O2的情况下，苯硼基团被转化为苯羟基，从而增强了NIR-II荧光(900−1200 nm)和吸收带(600−900 nm)，最终产生明显的NIR-II荧光信号和光声信号用于成像。该探针能够通过对生物标记物H2O2的响应，使用实时3D-MSOT和NIR-II荧光双模成像技术检测造影剂和缺血/再灌注诱导的小鼠AKI。

Scheme 1

实验内容：

1）PEG3-HC-PB探针的合成及性能研究。

完成探针PEG3-HC-PB和生色团PEG3-HC-POH(理论上是PEG3-HC-PB与H2O2反应的产物)的合成后，首先进行蛋白吸附试验，以确认水溶性的探针和生色团是否与蛋白发生非特异性结合并形成聚集体，影响肾脏对其的清除。实验结果表明。探针和发色团对蛋白质的吸附很低，这可能是因为长的结合骨架被位于两端和中间的三条生物兼容的PEG3链分割。

由于探针PEG3-HC-PB是水溶性的，所以在pH 7.4的PBS中测试了它的光谱性质和对H2O2的响应。图1A，B显示，随着H2O2水平的增加，PEG3-HC-PB探针在900−1200 nm范围内的荧光强度增强(峰值发射在950 nm)；而在没有H2O2的情况下，其荧光相当弱。随着探针PEG3-HC-PB与H2O2反应时间的延长，荧光强度相应增加，并在35分钟左右达到平衡。图1C显示了探针PEG3-HC-PB在没有或有H2O2的情况下的吸收光谱，很明显，随着H2O2剂量的增加，在600−900 nm处的吸光度增加(峰值吸光度在830 nm处)。接着测量用不同剂量的H2O2处理探针PEG3-HC-PB后的光声信号，在680−900 nm范围内，最大光声信号在约830 nm处，且光声信号随着H2O2剂量的增加而增加（图1D）。以上结果表明，PEG3-HC-PB探针能够有效地响应H2O2，从而发出明显的光声信号以及用于H2O2检测的NIR-II荧光信号。

接着使用808 nm激光(250 mWcm−2)连续照射60min，考察探针PEG3-HC-PB与H2O2以及生色团PEG3-HC-POH孵育后的光稳定性。如图1E所示，与H2O2和发色团PEG3-HC-POH孵育后的探针PEG3-HC-PB较IR808和ICG具有更好的光稳定性。探针PEG3-HC-PB与H2O2或发色团PEG3-HC-POH孵育后，即使在连续激光照射60min后，也只显示出轻微的荧光信号损失，而ICG和IR808被快速光漂白，表明该探针和发色团具有良好的光稳定性。良好的水溶性、低蛋白质结合率、良好的光稳定性以及对H2O2的响应都证明了该探针设计策略的有效性。

实验测试了该探针对H2O2响应的选择性和抗干扰性。为此目的，分别加入H2O2 (140 μM)或其他生物相关和潜在的干扰物质(半胱氨酸、谷胱甘肽、L-异亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、丙氨酸、葡萄糖、精氨酸、NaNO2, Na+ , K+ , Ca2+, Mg2+, NaClO, and ONOO−) 35min后，测量其在950 nm处的荧光强度。图1F显示，在探针(20 μM)与H2O2 (140 μM)反应时，荧光显著增强。相比之下，探针与其他物质的反应只产生微弱的荧光强度。此外，这些物质中的每一种与H2O2共存对探针对H2O2的荧光强度几乎没有任何影响。在加入H2O2 (65 μM)和其他每种物质的情况下，也测量了探针(10 μM)的光声信号。实验结果显示，只有在探针(10 μM)与H2O2 (65 μM)反应后，光声信号才明显增强，而探针与其他物质反应后仅能观察到轻微的光声信号。这些物质中的每一种与H2O2共存对探测器在光声信号方面对H2O2的响应没有影响。这些实验结果表明，探针PEG3-HC-PB可以作为一种H2O2激活的显像剂，具有明显的荧光信号和光声信号，且对H2O2的响应具有良好的选择性和抗干扰性。

为了确定探针PEG3-HC-PB对H2O2的反应机理，如方案1B所示，记录了探针溶液与H2O2反应后的吸收光谱和荧光光谱，并与合成的生色团PEG3-HC-POH进行了比较。可以看到吸收光谱和荧光光谱非常相似，表明探针PEG3-HC-PB与H2O2反应后转化为生色团PEG3-HC-POH。进一步通过高效液相色谱和HR-MS的数据进行验证，如图1G所示，探针与H2O2反应后在保留时间5.83分钟出现一个新的峰，与发色团PEG3-HC-POH一致，而保留时间为2.71分钟的峰减少，与探针Peg3-HC-PB一致，证实了PEG3-HC-PB与H2O2反应后已转化为PEG3-HC-POH。此外，还进行了HR-MS测量，对于与H2O2反应后的探针PEG3-HC-PB(图1H)，明显地在m/z 1150.6726处出现了与PEG3-HC-POH([M]+)相匹配的新峰。这些数据证实了H2O2裂解PEG3-HC-PB中的硼酸基(识别元件)，最终产生生色团PEG3-HC-POH。

在进行动物实验前，对PEG3-HC-PB探针的生物安全性进行了评价。实验组小鼠由尾静脉注射溶于生理盐水的探针PEG3-HC-PB，对照组为健康小鼠，比较对照组和实验组两组小鼠体重的差异。结果表明两组小鼠的体重没有明显差异。采用HE染色对两组小鼠的主要脏器组织进行组织学分析，对照组和实验组之间的差异不大。对于激活的探针PEG3-HC-POH，血液循环半衰期约为75分钟。活化的探针主要在5h内在肾脏内蓄积，并在静脉注射后24h内被清除。此外，还测定了健康小鼠在静脉注射24小时后对PEG3-HC-PB探针的肾清除效率，约为83%。这些数据证实了探针PEG3-HC-PB具有良好的生物安全性，适合于体内生物成像。

Figure 1

2）造影剂诱发小鼠急性肾损伤的影像研究。

首先尝试应用PEG3-HC-PB探针在小鼠体内检测造影剂DTZ诱导的AKI。DTZ在临床上用于尿路造影，由于其被肾脏完全清除，经常引起包括肾小管上皮细胞毒性和肾脏血流动力学改变在内的不良反应，造成急性肾损伤。H2O2在各种AKI的发生发展中起重要作用，并且在AKI时的肾区过度表达，可以作为AKI的内源性原位生物标志物。按文献报道的方法静脉注射不同浓度的DTZ建立AKI小鼠模型。如图2A所示，小鼠静脉注射DTZ后24小时，静脉注射探针PEG3-HC-PB，对小鼠进行NIR-II荧光成像和MSOT成像实验。如图2B、C所示，在NIR-II荧光图像中，由于肾脏代谢的原因，肾区的荧光信号在注射探针后约5小时内增加，然后减弱，直至24小时完全消失。随着DTZ剂量的增加，NIR-II荧光信号增强，DTZ水平越高，肾脏损伤越严重。图2D显示，与对照组(健康小鼠组)相比，模型小鼠的肾脏随着DTZ剂量的增加而变得苍白和肿胀(水肿)。这些结果再次提示DTZ可引起AKI，且肾脏损伤随DTZ剂量的增加而加重。此外，图2E显示了注射探针PEG3-HC-PB后5小时各组小鼠主要器官(包括心、肺、肝、脾和肾脏)的NIR-II荧光强度；图2F显示了不同组小鼠主要器官的NIR-II荧光图像，其中肾脏的荧光信号较强，且肾脏的荧光强度随DTZ剂量的增加而增强，这与体内NIR-II成像数据一致。此外，与对照组(健康小鼠)相比，随着DTZ水平的增加，小鼠的体重出现了更明显的下降，进一步证实了DTZ对肾脏的毒性。

Figure 2

接着用探针PEG3-HC-PB通过MSOT成像检测造影剂(DTZ)诱导的AKI。图3A、B显示了静脉注射探针PEG3-HC-PB后不同时间记录的小鼠MSOT横断面图像。与正常对照组(即健康小鼠组)相比，在静脉注射探针5h后，模型组小鼠肾脏MSOT信号增强，DTZ水平升高(图3A)。MSOT成像结果显示，在注射PEG3-HC-PB探针后，肾脏MSOT信号增强，并在5h时并达到最大值，随后由于肾脏代谢的原因，MSOT信号减弱。接着，为了从不同的角度证实对比剂DTZ诱导的AKI，用肌酐测定试剂盒和尿素测定试剂盒测定了小鼠的SCR和BUN。给予较高剂量DTZ的小鼠，SCR和BUN水平均明显高于对照组(健康小鼠)（图3C，D）。此外，从三组小鼠静脉注射探针PEG3-HC-PB(图3E)后覆盖部分小鼠躯干的3D-MSOT图像可以明显看出，接受高剂量DTZ的小鼠肾区MSOT信号比对照组强得多（图3E）。显然，这些MSOT成像结果与NIR-II荧光成像数据具有很好的一致性。上述结果也证实了DTZ剂量越大，肾损伤越严重。

然后对各组小鼠的主要脏器进行MSOT成像。与其他器官相比，注射DTZ的模型鼠肾脏的MSOT信号要明显得多。对不同组小鼠肾组织切片的进行组织学分析，图3F中的H&E染色图像显示，与对照组(健康鼠)相比，模型组小鼠肾小管扩张和空泡化变性。DTZ高剂量组肾脏损害较低剂量组明显加重，进一步证明造影剂确实对肾脏有损害，且随着造影剂剂量的增加，肾损伤程度加重。

Figure 3

3）小鼠肾缺血/再灌注性急性肾损伤的影像研究。

在小鼠肾缺血/再灌流(I/R)所致急性肾损伤模型中进一步验证PEG3HC-PB探针的应用。肾I/R损伤是AKI的一种(主要临床症状是快速肾功能障碍，发病率和死亡率高)。在肾I/R损伤时，肾脏过度产生H2O2，从而导致局部炎症和细胞凋亡加剧，进一步加重肾脏损伤。利用PEG3-HC-PB探针，通过对肾脏内源性H2O2的反应来检测I/R导致的AKI。采用3组小鼠，其中1组为对照组(健康小鼠行无缺血的中线切开手术)，2组为模型组(即健康小鼠通过夹闭双侧肾蒂造成不同时间(30或60min)的缺血，然后再灌流24 h)。图4A显示了肾脏I/R损伤的过程和双模成像实验。在肾缺血/再灌流诱导的AKI小鼠模型的外科手术过程中，在缺血30或60分钟后，肾脏的颜色由血红变为深紫色，然后在血液再灌流时又恢复为红色(去除血管夹后)。

图4B、C的NIR-II荧光图像和荧光强度显示，在注射PEG3-HC-PB探针后5h，对照组肾脏区域几乎没有荧光，而模型组肾脏区域有明显的荧光信号。与缺血时间短(缺血时间30min，再灌注时间24h)相比，缺血时间长(缺血60min，再灌流时间24h)组的荧光信号更明显，这可能是由于缺血时间较长(60min)，导致肾脏产生更多的H2O2，从而导致更严重的肾损伤。图4D显示了每组小鼠器官(包括心、脾、肝、肺和肾)在静脉注射探针PEG3-HC-PB后5小时的NIR-II荧光图像，其NIR-II荧光强度如图4E所示。从这些图中可以看到，在主要器官中，肾脏的荧光信号要强得多，并且随着缺血时间的增加，荧光强度也增加，这与NIR-II活体成像数据是一致的。如图4F所示，与对照组相比，缺血60分钟的模型小鼠的肾脏变得苍白，并有明显的水肿。这些数据表明，增加缺血持续时间会加剧AKI。此外，与对照组相比，随着缺血时间的延长，小鼠的体重下降更加明显，这进一步证实了随着缺血时间的延长，肾脏缺血−再灌注损伤变得更加严重。

Figure 4

继续，利用探针PEG3-HC-PB对肾I/R损伤进行MSOT成像检测和成像。图5A、B为小鼠静脉注射PEG3-HC-PB后不同时间段的MSOT横断面图像。与对照组相比，在静脉注射探针PEG3-HC-PB后5 h，模型小鼠肾区出现明显的MSOT信号(图5A)。采集静脉注射PEG3-HC-PB后不同时间的MSOT图像。MSOT成像结果显示，在注射探针PEG3-HC-PB后，肾区MSOT强度增强，约5h达到最大，随后由于肾脏代谢作用，MSOT强度缓慢减弱(图5B)。通过商业试剂盒(肌酐和尿素分析试剂盒)检测每组小鼠的SCR和BUN水平，进一步证实了I/R诱导AKI的可靠性。如图5C，D所示，缺血时间较长的小鼠，SCR和BUN水平均明显高于对照组，且缺血时间越长，肾脏损伤越严重。从三组小鼠静脉注射探针PEG3-HC-PB后覆盖部分小鼠躯干的3D-MSOT图像(正交视图图像)(图5E)也可以明显看出，缺血时间较长的小鼠肾区MSOT信号明显强于对照组。

然后对三组小鼠的主要器官进行MSOT成像。模型组(缺血时间为30或60分钟，再灌注时间为24小时)小鼠肾脏的MSOT信号较其他器官强，且随着肾脏缺血时间的增加，MSOT信号逐渐增强。这与体内影像学观察一致，肾缺血时间越长，肾损伤程度越重。对三组小鼠的肾组织切片进行组织学分析，如图5F所示。在H&E染色图像中，与对照组相比，缺血时间较长组(60min)和缺血时间较短组(30min)均有明显的肾小管扩张和空泡化变性。并且，缺血时间越长(60min)，肾脏损害越严重。以上结果都证实肾脏I/R确实可引起肾脏损伤，且缺血时间越长，急性肾损伤程度越重。

Figure 5

结论：本研究设计的PEG3-HC-PB探针具有良好的光稳定性、水溶性、肾脏清除性和生物标记物的活性，可用于通过NIR-II荧光和MSOT双模成像的技术检测活体AKI。

在AKI的情况下，肾脏中病理水平的H2O2激活探针PEG3-HC-PB，导致发色团PEG3-HC-POH的释放，并相应地释放强烈的NIR-II荧光信号和光声信号。该探针已被用于检测造影剂(DTZ)和肾脏肾缺血/再灌注诱导的小鼠AKI，可作为MSOT和NIR-II荧光双模成像检测和监测AKI的可操作工具。此外，3D-MSOT图像可以以时空方式用来定位疾病部位。这一策略可能为设计响应其他生物标志物的基于七甲基花菁的NIR-II探针以及设计其他用于疾病成像应用的NIR-II探针提供新的视角。

参考文献

Zeng, C., Tan, Y., Sun, L., Long, Y., Zeng, F., & Wu, S. (2023). Renal-Clearable Probe with Water Solubility and Photostability for Biomarker-Activatable Detection of Acute Kidney Injuries via NIR-II Fluorescence and Optoacoustic Imaging. ACS Appl Mater Interfaces, 15(14), 17664-17674.

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