非变性SEC-MS分析单克隆抗体时色谱柱的选择

2023-05-24 20:56:19 东曹（上海）生物科技有限公司

单克隆抗体的表征对于产品的安全性和有效性至关重要。确定纯度和表征二聚体或片段等杂质是两个关键的质量参数。尺寸排阻色谱（SEC）与质谱（MS）联合使用在测定mAb精确分子量方面的应用也越来越广泛。然而，即使在高分子量m/z范围内执行操作，传统SEC一般都会产生大量的颗粒脱落，导致电离效率随时间推移逐渐降低。为避免MS和MALS检测时产生颗粒脱落，东曹开发了一款U/HPLC尺寸排阻色谱柱TSKgel UP-SW3000-LS。

本应用中，我们使用了TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱对mAb标准品进行了SEC-MS分析。数据表明，就MS观察到的颗粒脱落情况，TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱优于其他品牌的UHPLC-SEC色谱柱。此外，与50次以上的初始进样相比，此款色谱柱有助于将电喷雾电离（ESI）源的电离效率保持在90%以上。

显著降低SEC-MS检测的颗粒脱落

根据我们的首次观察结果，颗粒脱落不会只在特定的保留时间下发生。该现象会在整个洗脱过程种连续发生。因此，我们决定收集3到15分钟洗脱时间内的累积数据，以此量化单次SEC运行期间色谱柱的脱落量（图1）。

图1 LC-MS测量SEC颗粒脱落的实验设计

我们计算了每根色谱柱中不同分子离子的测量强度，量化了多次运行SEC时色谱柱的颗粒脱落。分析序列包括10次平衡运行（不进样）和10次普通运行（色谱柱中注入了流动相空白）。颗粒脱落的量化结果如图2所示，其中横轴为运行次数，纵轴为颗粒脱落的强度或每秒计数量（cps）。

图2 LC-MS量化SEC颗粒脱落

TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱首次平衡后几乎无颗粒脱落，且在颗粒脱落方面优于其他品牌UHPLC-SEC色谱柱和光散射专用色谱柱。由于首次平衡后无法测量颗粒脱落，因此无需在开始分析前长时间调节SEC色谱柱。

提高SEC-MS的电离效率

我们通过测定28+峰的峰面积，来定量NIST mAb单体洗脱峰在不同色谱柱上连续50次以上进样的MS电离效率（见图3和图4）。我们发现电离效率降低与高颗粒脱落之间具有相关性。

TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱具有超低的高颗粒脱落率，50次以上进样时，可保持较高的电离效率（90%以上）。

图3 SEC-MS分析mAb

图4 电喷雾电离时mAb的电离效率

结果与讨论

使用TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱进行SEC-MS分析，有助于减少色谱柱脱落，能够显著提高整体分析性能。相较于其他品牌色谱柱，还有助于通过降低ESI源的清洗频次保证仪器的正常运行时间。因此，使用TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱时，不仅SEC-MS分析的重复性和可靠性更高，通量也更高。