案例分享 | 北大药学院借助MST技术检测蟾毒灵与E2F2转录因子间的相互作用

转录因子E2 因子 (E2F) 家族是参与细胞周期及细胞凋亡的重要调节因子。作为E2F家族的重要成员，E2F2的异常表达总与各种癌症的不良预后高度相关，例如，E2F2水平在晚期肝细胞癌中普遍上调，E2F2高表达的患者生存率普遍较低，这表明E2F2具有成为抗癌靶标的潜在价值。因此，选择性抑制E2F2功能的潜在治疗策略的发现引起了广泛关注。然而E2F2 作为转录因子，缺乏典型的配体结合域，传统上被认为是“不可成药”的靶点。分子胶是一类小分子，可以诱导蛋白质-蛋白质相互作用，以驱动以前不可成药的蛋白质降解。但到目前为止，仍未见有关具有选择性 E2F2 靶向特性的分子胶的报道。

为了探索 E2F2 降解策略，北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞与曾克武团队使用中药蟾酥主要活性蟾毒灵（Bufalin，BF）作为化学探针来确定其在肝细胞癌 (HCC) 中的药理作用。结果表明，一种新的非典型E3连接酶ZFP91可作为降解E2F2转录因子的药物靶点。此外，实验发现蟾毒灵具有分子胶的功能，可以有效诱导转录因子E2F2与非典型泛素连接酶ZFP91形成E2F2-ZFP91-蟾毒灵三聚体复合物，进而促进E2F2的泛素化和蛋白酶体途径降解。

在检测E2F2与蟾毒灵互作时，构建了带有his-tag标签E2F2质粒，在HEK293T细胞中过表达。裂解后，使用NanoTemper RED Tris-NTA试剂盒特异性标记裂解液中his-tag E2F2，使其带上荧光，然后向裂解液中加入梯度稀释的蟾毒灵。微量热泳动 (MST) 实验表明，蟾毒灵直接与E2F2结合，解离常数为3.15 ± 1.43 μM（图2）。

图2注：MST检测裂解液中E2F2与蟾毒灵的亲和力

在检测蟾毒灵与ZFP91互作时，作者构建pEGFP-N1-ZFP91质粒转染导HEK293T细胞中过表达，裂解后取上清，将上清液中的EGFP-ZFP91直接作为荧光信号源，加入梯度稀释的蟾毒灵。MST测定显示蟾毒灵以 462 ± 146 nM的解离常数（K_d）与ZFP91结合（图3）。

图3注：MST检测裂解液中ZFP91和蟾毒灵的亲和力

蟾毒灵可拆分成α-吡喃酮（α-Pyr）与DHA两个结构，团队通过MST实验证明α-Pyr直接与ZFP91蛋白结合（K_d = 900 ± 322 nM），但不与ZFP91的C349A突变结合（K_d未检测到）（图4），表明α-Pyr是蟾毒灵与ZFP91发生结合的关键基团。综合其他结果，团队提出蟾毒灵可以作为分子胶介导E2F2-ZFP91复合物的形成，进一步促进E2F2的泛素化和降解。

图4注：MST 展示了α-Pyr和GFP-ZFP91之间的直接相互作用

总的来说，这项研究进行了基于分子胶的E2F2癌症治疗靶向策略的概念验证，在癌症治疗中具有广阔的药用价值。同时，该研究还揭示了蟾毒灵作为天然“分子胶水”发挥抗肿瘤作用的独特药理机制，也为抗肿瘤药物的设计提供了具有中医药特色的新颖靶点与先导药物分子。