TPD业务介绍 | 蛋白泛素化与泛素化组确定蛋白降解类药物作用机制（MOA）

蛋白泛素化是由E3泛素连接酶介导的蛋白质泛素化修饰并随后通过蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）引起目标蛋白降解，从而维持细胞内稳态的一个重要生物学过程。利用这种天然存在的蛋白质调控机制，近年来通过小分子化合物 （PROTAC或分子胶）可以促进E3泛素连接酶与一些疾病相关目的蛋白 （Protein of Interest，POI）之间的相互作用，引起这些疾病驱动（Disease-driver）蛋白的泛素化修饰和特异性降解，从而达到治疗的作用。随着越来越多的蛋白降解类药物分子进入前临床发现和临床试验阶段，通过POI的泛素化的特异性识别和量化，泛素化修饰组学能够获取泛素化程度和动态的信息，帮助我们理解这些化合物的作用机制和疗效，为提高分子结构活性优化 （SAR）提供直接的数据支持。此外，泛素化修饰组学可以通过分析细胞或组织样本的泛素化模式来识别靶向蛋白质降解剂的潜在脱靶效应。从而降低由于脱靶效应造成的临床不良反应的风险。

图1 PROTAC降解剂工作原理

质谱能够精确测量蛋白质或多肽的分子量，从而能够识别泛素化肽段上的双甘氨酸残基标签（diGly）的分子量偏移（+114.04292, th），实现蛋白质泛素化修饰的大规模检测（图2）。

泛素化修饰是指底物蛋白质中的赖氨酸（K）ε氨基与泛素分子中双甘氨酸（diGly）中末端甘氨酸的羧基形成酰胺键的过程，通过胰蛋白酶对精氨酸（R）赖氨酸（K）的切割后会形成K-GG的特征序列（图3）。

由于泛素化修饰往往丰度低且动态范围广，检测前首先需要对修饰的肽段进行富集，才能进行质谱鉴定。因此我们首先进行了泛素化多肽的动物免疫，并获得了针对泛素化修饰的Untangled Bioscience K-ε-GG Antibody抗体。使用SpikeMix™ PTM-Kit 47-Lys(GG)标准化泛素化修饰肽段进行了富集效率的评价（图4）。

图4 Untangled Bioscience K-ε-GG Antibody抗体特异性评价

通过与PTMScan® Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit直接比较发现，Untangled Bioscience K-ε-GG Antibody抗体的修饰鉴定数与前者伯仲之间，数据重叠超80%，显示出很好的一致性（图5）。

图5 Untangled Bioscience K-ε-GG Antibody抗体鉴定深度评价

此外，超过96.54%的泛素化修饰蛋白质、93.51%的泛素化修饰肽段能够被重复鉴定，显示出Untangled Bioscience K-ε-GG Antibody抗体在泛素化修饰鉴定上的良好重复性。（图6）。

图6 Untangled Bioscience K-ε-GG Antibody抗体鉴定重复性评价

来那度胺是一种对多发性骨髓瘤和其他B细胞肿瘤具有临床疗效的药物，为了分析来那度胺的作用机制，利用泛素化修饰组学，发现来那度胺会导致IKZF1和IKZF3的泛素化升高；此外，通过全蛋白质组鉴定发现，来那度胺降低了IKZF3和IKZF1的丰度。而IKZF1和IKZF3是多发性骨髓瘤的基本转录因子（图7）。

图7 泛素化修饰组学揭示来那度胺的作用机理