临床专栏丨液质联用技术用于血浆中曲妥珠单抗的定量分析

2023-04-24 10:14:57, 薛静晶艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

背景

曲妥珠单抗（Trastuzumab）是一种重组人源化单克隆抗体，可抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖，临床上可用于HER2过度表达的转移性乳腺癌、转移性胃癌患者。赫赛汀（Herceptin）是罗氏原研生物制剂——注射用曲妥珠单抗，最早于1998年9月25日获得美国FDA批准上市，之后相继在欧洲、日本上市，2002年9月在我国上市。

血浆药物的定量分析是任何药代动力学临床前和临床研究的必要前提。在临床用药中，由于单抗药物ADME个体差异大，血药浓度的准确测定不仅为患者提供有效和安全的精准用药指导，提高药物疗效，并且有助于深入研究药代动力学参数和生物标志物^[1,2]。经过十几年的发展，基于液质联用（LC-MS/MS）的蛋白定量技术正步入一个新的阶段，该方法越来越多被视为抗体药物生物分析的一个成熟平台，常被用于临床前研究、开发和临床试验。经典液质蛋白定量方法开发工作流程一般首先从样品中提取感兴趣的蛋白，经酶解成一系列多肽，并通过LC-MS/MS定量其中一个或多个特征多肽（signature peptide，SP），通过选择合适SP和标准物质，液质方法能够在灵敏度、选择性、精密度和准确性方面达到或超过传统的配体结合测定法（LBA） ^[3,4]。

本应用首先将血浆曲妥珠单抗样本酶解，后采用96孔板固相萃取法净化酶解后的肽段混合物，使用液质联用MRM模式定量分析特征肽段，操作简便，灵敏度高，方法精密度、加标回收率良好。

实验样品

基质：大牛血浆

表1. 化合物信息

中文名称	英文名称	CAS号	分子式	分子量
赫赛汀	Herceptin	180288 -69-1	C₆₄₇₀H₁₀₀₁₂ N₁₇₂₆O₂₀₁₃S₄₂	145531.50

样品前处理方法：

采用艾杰尔96孔固相萃取板Cleanert Peptide专用板1净化酶解后的血浆样本，具体步骤如下：

酶解
活化，上样
淋洗
洗脱
氮干复溶

仪器分析条件

色谱柱： Luna Omega Polar C18，

1.6µm，2.1×50mm

流动相A相：0.1%甲酸水溶液；

流动相B相：0.1%甲酸乙腈溶液；

流速：0.3mL/min；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

质谱仪：SCIEX Triple Quad^™5500

扫描方式：多反应监测正负离子模式（MRM）

离子源类型：电喷雾离子源（ESI+）

喷雾针电压：5500V

离子源温度：500℃

加热器（GS1）：60psi

辅助加热气（GS2）：60psi

气帘气（CUR）：40psi

碰撞气（CAD）：9psi

表2. 化合物定性、定量离子和质谱分析参数

特征肽段	Q1	Q3
FTISADTSK	485.2	721.4

结果与讨论

线性范围：

配制浓度范围20-1600ng/mL赫赛汀大牛血浆溶液作为样品进行检测并以外标法绘制标准曲线。得到线性相关系数r=0.9990，线性良好。

图1. 大牛血浆基质20-1600ng/mL线性

方法精密度与准确度：

本实验选择400ng/mL加标平行测定3次，以外标法计算回收率与精密度结果，由表3可知回收率为103%~110%，相对标准偏差RSD小于5%；

表3. 加标回收实验结果

特征肽段（SP）	理论加标浓度（ng/mL）	检测结果（ng/mL）	回收率%	RSD%
FTISADTSK	400	410	103	3.8
	400	413	103
	400	439	110

参考灵敏度：

本实验对加入赫赛汀浓度为20ng/mL的血浆样本进行分析，其特征肽段信噪比为32，满足临床TDM定量要求。

图2. S/N为32.4的20ng/mL加标色谱图

结论

本文建立了赫赛汀单抗血浆基质的SPE前处理方法，其20ng/mL信噪比为32，能够满足检测需求，400ng/mL外标法添加回收率在103%~110%之间，RSD值均小于5%，能够满足标准检测方法要求。本实验避免了超滤管的使用，从而极大降低了样本的检测成本。

相关耗材产品：

产品名称	规格描述	包装数量	订货号
色谱柱	Luna Omega Polar C18, 1.6μm 2.1×50mm	1/PK	00B-4748-AN
SPE板	Cleanert Peptide 专用板1, 5mg	2/PK	Peptide-1-MW
保护柱卡套	Security Guard Kit	1/PK	KJ0-4282
保护柱柱芯	4×3.0mm	10/PK	AJ0-4287

飞诺美抗体药物关键质量属性解决方案

——Biozen系列

应用		色谱柱
聚集体分析	mAb片段，较小的生物类似药	1.8μm SEC-2
聚集体分析	mAb聚集体	1.8μm SEC-3
完整质量数	完整质量数	3.6μm Intact C4
完整质量数	DAR, Middle-Down	3.6μm Intact XB-C8
肽谱	序列变异分析、序列确认， “符合标准”QC测试	1.7, 2.6μm Peptide XB-C18
肽谱	序列变异分析、序列确认， “符合标准”QC测试	1.6, 3μm Peptide PS-C18
N-连接糖谱	通过N-连接糖基释放和标记进行糖链异质体相对丰度的分析	2.6μm Glycan
电荷异构体	分析mAb和重组蛋白的酸性碱性电荷异构体	6um WCX

完整质量数

完整质量不仅可以指示糖型的相对丰度，还能表明稳定性，这是因为降解的mAb不会在ESI-MS下形成良好的电荷包膜。高分辨率MS所能提供的完整质量可确定翻译后修饰，尤其是糖型的相对丰度，这将与Biozen Intact XB-C8和Biozen WidePore C4提供的快速运行时间和紧密峰形的优点完美结合在一起。

使用Biozen Intact XB-C8和SCIEX X500B表征曲妥珠单抗生物仿制药的完整质量数

色谱柱：Biozen 3.6μm Intact XB-C8

色谱柱：150x2.1mm

货号：00F-4766-AN

流动相：A:0.1%甲酸的水溶液

B:0.1%甲酸的乙腈／异丙醇（50:50)溶液

梯度：

时间(min)	%B
2.5	20
10	65
10.1	95

流速：0.3mL/min

温度：90℃

检测：QTOF (SCIEX X500B)

样品：曲妥珠单抗

药物抗体比（DAR)

由于对功效和安全性有直接影响，因此必须清楚了解每个ADC的连接子。Biozen Intact XB-C8为确定ADC的载药量分布和DAR提供了出色的工具。其大孔径的特点允许完整的ADCs与中等保留的固定相相互作用，而核－壳颗粒则提供更高的柱效，为具有不同载药量的ADC提供所需的分离度。

赫赛汀-vcMMAE，

使用Biozen 3.6μm Intact XB-C8

赫赛汀-mcMMAF，

使用Biozen 3.6μm Intact XB-C8

参考文献：

[1]. Legeron R, Xuereb F, Chaignepain S, Gadeau A.P, Claverol S, Dupuy J.W, Djabarouti S, Couffinhal T, Schmitter J.M；Breilh D. A new reliable, transposable and cost-effective assay for absolute quantification of total plasmatic bevacizumab by LCMS/MS in human plasma comparing two internal standard calibration approaches. Journal of Chromatography B, 1070, 43–53(2017).

[2]. Marin, C., Khoudour, N., Millet, A.,Lebert, D., Bros, P., Thomas, F., Ternant, D., Lacarelle, B., Guitton, J.; Ciccolini, J.; et al. Cross-Validation of a Multiplex LC-MS/MS Method for Assaying mAbs Plasma Levels in Patients with Cancer: A GPCO-UNICANCER Study. Pharmaceuticals. 14, 796. (2021).

[3]. Van De Merbel, N. C., Olaleye, O., Spanov, B., Bischoff, R. Large molecule bioanalysis by LCMS: Beyond simply quantifying. Bioanalysis, 14(7), 397-400(2022).

[4]. Bronsema KJ, Bischoff R, van de Merbel NC. High-sensitivity LC–MS/MS quantification of peptides and proteins in complex biological samples: the impact of enzymatic digestion and internal standard selection on method performance. Anal. Chem. 85(20),9528–9535 (2013).