Nature Medicine | 肠道微生物代谢5-ASA降低其在IBD中的临床疗效

炎症性肠病（IBD）是一种慢性胃肠道疾病，抗炎药物5-氨基水杨酸（5-ASA）被认为是当前IBD最常用的治疗方法之一，但存在个体间的药效差异。已知微生物组对药物在体内的药代动力学过程产生影响， 5-ASA的药效差异是否与微生物代谢相关尚不清楚。

近日，麻省理工和哈佛大学Raaj S. Mehta及其团队的一项题为“Gut microbial metabolism of 5-ASA diminishes its clinical efficacy in inflammatory bowel disease”的研究成果发表在Nature Medicine杂志上（IF:87.241）。研究以肠道微生物组如何解释个体间5-ASA的药效差异为导向，结合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学的多组学联用技术，最终发现了与5-ASA使用者治疗失败风险增加有关的微生物酶，为治疗IBD开辟了新的途径，推进了基于微生物组的个性化医疗的发展进程。

图1. 研究设计思路图

来自IBD患者的多组学研究确定了5-ASA的使用

利用人类微生物组项目炎症性肠病多组学数据库（IBDMDB，http://ibdmdb.org），对79名克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC）患者的粪便样本进行多组学分析，共鉴定了1036个宏基因组（MGX）、440个元转录本（MTX）和508个非靶向代谢组（MBX），以及283个MBX-MGX对和213个MGX-MTX对。随后针对13名新使用5-ASA的患者来确定5-ASA在体内直接调节的特定粪便代谢物，结果发现5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈显著差异，且经5-ASA治疗后，赖氨酸合成途径中的细菌代谢产物—2-氨基己二酸的含量减少，烟酸代谢也发生了显著变化。

进一步评估微生物、宿主和其他因素对这些差异显著的代谢物的相对贡献，最终发现5-ASA的药物水平在确定5-ASA调节代谢物水平方面具有最大的预测能力（35%），其次是微生物组特征（15%）和其他宿主因素（7%）。随后，通过另一个独立的IBD患者队列中鉴定并验证了两种可能的5-ASA衍生物—N-丙酰基5-ASA和N-丁酰基5-ASA，它们的变化可以部分地由肠道微生物组来解释。

图2. 5-ASA可直接影响粪便代谢组，并通过微生物组进行生物转化

5-ASA代谢肠道微生物酶的鉴定

接下来确定参与5-ASA生物转化的肠道微生物酶。首先对服用及未服用5-ASA的患者微生物进行转录组分析，最终鉴定了两个显著过表达的具有推定乙酰转移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰辅酶a乙酰转移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四个具有乙酰辅酶a乙酰转移酶结构域的候选基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。随后将粪便样本分为N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/阴性水平两组，计算与N-乙酰5-ASA相关的每个元转录组基因簇的敏感性和特异性，结果发现了另外7个假定的乙酰转移酶基因簇与使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相关。

最终得到的12个之前未被表征的候选乙酰转移酶可分为硫解酶和酰基辅酶A N-酰基转移酶两组，其中酰基辅酶A NAT家族比硫解酶家族表现出更大的序列异质性，且酰基辅酶A NAT酶几乎都来自拟杆菌门，而硫解酶来自厚壁菌门。通过研究菌株水平的基因组，同样发现了一部分普氏镰孢菌株编码相关的乙酰转移酶。

图3. N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和酰基辅酶A N-乙酰转移酶

5-ASA失活酶生化特性的推定

为了推测硫解酶和酰基辅酶A NAT超家族具有潜在的5-ASA灭活能力，选用来自厚壁菌门的候选硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和来自福氏假单胞菌的酰基辅酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于进一步的生化表征。用已知的肠道链球菌酶作为阳性对照，对乙酰化5-ASA采用体外质谱分析，最终证实了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii酰基辅酶A NAT具有使用乙酰辅酶A乙酰化5-ASA的能力。

随后测试了硫解酶对其他含胺基异生素（包括5-ASA异构体4-ASA、异烟肼、普鲁卡因胺和肼屈嗪）的乙酰化活性，结果并未发现这些化合物的任何乙酰化，这表明了硫解酶的底物选择性。此外，编码第二个预测的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培养物也能够将5-ASA乙酰化为N-乙酰基5-ASA。

为了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙酰化5-ASA，将FcTHL的乙酰化未配体晶体结构叠加在乙酰化硫解酶晶体结构上，与来自充分表征的革兰氏阴性分枝菌（ZrTHL）的乙酰辅酶A复合。随后将FcTHL与NAT (PDB ID: 2PFR)的晶体结构进行比对，进一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位点是否类似于肠道链球菌NAT的活性位点，最终揭示了活性位点区域中的半胱氨酸和组氨酸三联体。

图4. 5-ASA在体外的乙酰化活性的证实

IBD治疗失败与5-ASA代谢酶的宏基因组携带有关

基于临床服用5-ASA的个体差异性，接下来检查12种乙酰转移酶的存在是否与5-ASA治疗失败有关。收集39名在任何时间点接受5-ASA治疗及使用类固醇患者的609份粪便样本，使用多变量逻辑回归模型，调整与疾病风险相关了因素-年龄、性别、吸烟状况和IBD亚型，纳入每个参与者的NAT2表型来解释宿主遗传，最终发现粪便样本中存在4种乙酰转移酶基因与类固醇起始风险增加显著相关。4种乙酰转移酶基因有三种来自硫解酶超家族，一种来自酰基辅酶A超家族。且较早的发病年龄和CD与UC状态相比，同样与开始使用类固醇的更高风险显著相关。但未发现类固醇使用风险和大肠杆菌NAT的宏基因组存在联系。

在敏感性分析中，微生物乙酰转移酶基因数量的增加与类固醇起始风险的增加显著相关；从未使用过5-ASA治疗的患者基因家族与类固醇的使用没有正相关。随后使用混合效应模型对参与者进行调整，发现存在三个或更多乙酰转移酶基因也与类固醇使用风险增加相关，这在随后在未使用类固醇的208名5-ASA使用者队列中得到了验证。

图5. 肠道微生物5-ASA灭活乙酰转移酶与5-ASA使用者治疗失败的更大风险相关

小结

本研究结合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学的多组学联用技术，解析了肠道微生物乙酰化5-ASA的酶，发现并验证了4种乙酰转移酶基因与5-ASA治疗失败风险增加相关，潜在机制与暴露于5-ASA时微生物的相关基因过度表达而导致药物失活有关。总之，本研究提供了特异性肠道代谢酶与IBD 5-ASA治疗失败之间的直接联系，解决了IBD管理中长期存在的挑战，对基于微生物组的精准医学具有深远的指导意义。

参考文献

Mehta RS, Mayers JR, Zhang Y, et al. Gut microbial metabolism of 5-ASA diminishes its clinical efficacy in inflammatory bowel disease. Nature Medicine. 2023.

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