代谢组学+转录组学/蛋白质组学科研思路，做完大概发7分

在过去的数十年间，高通量组学技术广泛应用于生命科学和医学的基础研究。传统单一组学因其难以系统全面地解析复杂生理过程的调控机制，有其应用局限性，因此近年来越来越多临床基础科研进入多组学时代。

多组学研究可以从基因、转录、蛋白和代谢等多个水平进行全局性研究，同时还能够相互验证，减少单一组学分析的局限性和假阳性，有助于构建机体调控网络，深层次阐述各分子水平之间的调控关系及因果关系。其中，研究基因与表型间关联的转录组学/蛋白质组学+代谢组学的多组学联合研究占据了一席之地。这类研究即揭示了疾病的多分子特征，又能从“因”和“果”两个层次上寻找潜在的关键通路或/和关键基因，以此为基础将帮助研究者挖掘详细的作用机制。

本文，我们通过几篇研究案例，了解下这类多组学联合应用的常见思路。

1. 先描述转录组学/蛋白质组学和代谢组学层面上的分子特征；

2. 对差异基因/差异蛋白质和差异代谢物进行表达相关性分析；

3. 鉴于差异基因/差异蛋白质及差异代谢物均可进行KEGG通路富集分析，可通过比较两个组学的KEGG富集结果，找到共有的富集通路。这些共有富集通路得到了两组学的印证，可能是疾病中关键的通路，而富集在其中的差异基因/蛋白质和差异代谢物即是重要的分子。

转录组学和代谢组学揭示了代森锰锌对小鼠肝脏毒性作用的分子机制

Transcriptomics and metabolomics revealed the molecular mechanism of the toxic effect of mancozeb on liver of mice

期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety  

影响因子：7.129  

PMID: 36007320

Mancozeb（MCZ，代森锰锌）是一种广谱杀菌剂，在过去几十年里被广泛用于作物(西红柿和土豆)，导致其在食物网中的积累。然而，MCZ对肝损伤的作用机制尚未见报道。本研究结合转录组学和代谢组学探讨MCZ对肝损伤的潜在机制。

（1）组学实验设计

转录组学：小鼠肝组织，MCZ处理组（n=3）、对照组（去离子水处理，n=3）

代谢组学：小鼠肝组织，MCZ处理组（n=6）、对照组（去离子水处理，n=6）

（2）研究结果

转录组学分析结果：PCA分析显示，MCZ组和对照组有明显的区分， 表明MCZ处理造成了广泛的基因表达变化。MCZ比对照组的差异比较分析共得到326个显著变化的基因，其中有155个上调基因，171个下调基因。差异基因的GO分析显示，显著富集的GO-生物过程是细胞凋亡。KEGG通路富集分析显示差异基因富集在化学致癌、流体剪切应力和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、亚油酸代谢、AMPK信号通路、类固醇激素生物合成和细胞凋亡。研究者挑选MAPK通路的差异基因进行了PCR验证，这些基因的变化趋势与转录组测序一致。

代谢组学分析结果：共鉴定和定量了641个代谢物。MCZ比对照组的差异比较分析共得到228个显著变化的代谢物，其中110个上调代谢物，118个下调代谢物。差异代谢物的KEGG通路富集分析显示了AMPK信号通路、cAMP信号通路、糖酵解/糖异生、柠檬酸循环（三羧酸(TCA)循环）的显著富集。

两组学联合分析找重要通路：研究者对差异基因和差异代谢物进行表达相关性分析，并以热图展示。通过比较共有的KEGG富集通路，发现AMPK信号通路中富集了更多的差异基因和差异代谢物。该结果提示，AMPK信号通路可能是MCZ诱导肝毒性的重要途径。

中枢性性早熟（CPP）女孩蛋白质组学和代谢组学的综合分析

Integrated analysis of proteomics and metabolomics in girls with central precocious puberty

期刊：Frontiers in Endocrinology

影响因子：6.055

PMID: 35966072

中枢性早熟(CPP)是一种多因素复杂疾病。关注单一分子特征的传统研究不能充分阐明该疾病的全景状况。本研究通过蛋白质组学和代谢组学分析，揭示中枢性早熟(CPP)的多分子特征，并探讨潜在的重要分子途径。

（1）组学实验设计：

蛋白质组学：人血清，中枢性性早熟女孩（CPP，n=10）、健康对照女孩（Control，n=10）

代谢组学：人血清，中枢中枢性性早熟女孩（CPP，n=10）、健康对照女孩（Control，n=10）

（2）研究结果：

蛋白质组分析结果：共定量了1002个蛋白质。CPP比对照组的差异比较分析得到134个显著变化的蛋白，其中有71个上调蛋白，63个下调蛋白。上调蛋白的GO-生物学过程富集前三分别是细胞外基质组织、细胞粘附和细胞蛋白代谢过程；GO-细胞组分富集的前三分别是细胞外泌体、细胞外区和细胞外间隙；GO-分子功能的前十位主要与结合功能有关。下调蛋白，GO-生物学过程富集的前三分别是免疫反应、先天免疫反应和通过经典途径的补体激活；GO-细胞组分富集的前三位和GO-分子功能的前十位与上调蛋白相似。KEGG富集结果显示了ECM受体相互作用、Fc-γR介导的吞噬作用、粘着斑、PI3K-Akt信号通路、肿瘤吞噬体和蛋白聚糖的富集。研究者对差异蛋白进行了蛋白-蛋白相互作用分析，并对连接度最高的25个蛋白进行重点展示。

代谢组分析结果：PCA分析CPP组和对照组有明显的区分，表明性早熟女孩存在明显的代谢异常。CPP比对照组的差异比较分析共得到103个显著变化的代谢物，其中42个上调代谢物，61个下调代谢物。研究者随后对103个差异代谢物进行了KEGG通路富集分析，主要富集在亚油酸代谢、神经活性配体受体相互作用、磷脂酶D信号通路、癌症中的胆碱代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢通路。

两组学联合分析找重要通路：研究者对TOP20差异蛋白质和TOP20的差异代谢物进行相关性分析，并绘制相关性热图。此外，研究者比较了两组学的KEGG通路富集结果，发现了6条共有富集通路：胰岛素抵抗、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、花生四烯酸代谢和醚脂代谢。研究者随后构建了这些KEGG富集通路-差异蛋白质-差异代谢物网络图。

（1）在前述简单研究思路的基础上，锁定调控代谢改变的关键基因（从差异基因或差异蛋白质中寻找，或从共有的/关键的KEGG通路中寻找）；

（2）验证关键基因/蛋白质是对代谢改变负责的，并揭示作用机制。

肠道脆弱拟杆菌改善小鼠肾纤维化

The gut microbe Bacteroides fragilis ameliorates renal fibrosis in mice

期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

PMID：36241632

研究者对慢性肾病（CKD）患者（n=10）和健康对照个体（n=10）的粪便进行16s DNA测序，发现Bacteroides fragilis（BF，脆弱拟杆菌）在CKD组中显著减少。随后，研究者在15个CKD和15个健康个体的独立队列中验证了这一发现。本研究旨在深入探索脆弱拟杆菌与CKD之间的关系和潜在作用机制。

（1）前期发现：

① 口服活性脆弱拟杆菌可以减缓UUO（单测输尿管梗阻）小鼠的肾纤维化；

② 口服活性脆弱拟杆菌可以减低脂多糖（LPS），抑制炎症；

③ 脆弱拟杆菌是通过抑制氧化应激和TGF-β/Smad信号通路减缓UUO小鼠的肾纤维化；

（2）组学实验设计：

代谢组学1：小鼠血清，UUO小鼠（UUO，n=7）、UUO小鼠+口服脆弱拟杆菌（UUO+BF，n=7）、对照组（Sham，n=7）

代谢组学2：人血清，CKD患者（n=115）、健康对照组（n=113）

蛋白质组学：小鼠肾组织，UUO小鼠（UUO，n=7）、对照组（Sham，n=7）

（3）研究结果：

小鼠血清代谢组分析结果：OPLS-DA分析显示UUO、UUO-BF和Sham组的代谢组学显著不同。UUO比Sham的代谢物差异比较共得到14个差异代谢物，而其中1,5-AG被报道是II型糖尿病可靠的糖化标志物。1,5-AG在UUO组中显著下降，而在UUO-BF组中则显著上调。

人血清代谢组分析结果：OPLS-DA分析显示疾病组和健康组的代谢物有显著区别。疾病组比健康组的差异代谢物分析共得到23个差异代谢物，包括1,5-AG。和小鼠血清代谢组的结果一致，1,5-AG在疾病组中显著下调。研究者随后用靶向代谢组学确认了在CKD患者中的1,5-AG较健康人显著低。

目标代谢物1,5-AG的功能研究：研究者通过实验明确1,5-AG可减缓UUO小鼠的肾纤维化。1,5-AG是TGR5的激动剂，体外和体内实验表明1,5-AG上调肾脏TGR5的蛋白表达。敲低TGR5废除1,5-AG在体外缓解肾纤维化的作用。

小鼠肾脏蛋白质组学分析结果：UUO组比Sham组的差异蛋白比较共获得216个上调蛋白和215个下调蛋白。其中，SGLT2在UUO组中显著下调。mRNA PCR和WB实验明确了在UUO组中，SGLT2显著下调，而口服活性脆弱拟杆菌后，UUO小鼠SGLT2的mRNA和蛋白水平上升。

目标蛋白质SGLT2与代谢物1,5-AG结合研究：分子对接和分子动力学模拟分析表明，1,5-AG可能和SGLT2结合。进一步实验表明，当SGLT2被抑制后，血清中的1,5-AG水平显著上升；而过表达SGLT2后，细胞对1,5-AG的吸收提升1.7倍。这些结果表明，1,5-AG是SGLT2的底物，在肾脏SGLT2负责对1,5-AG的重吸收。

发现活性化合物：研究者从14种与CKD相关的药草活性化合物中寻找可以通过脆弱拟杆菌缓解肾脏纤维化的药物。结果发现，仅有 madecassoside（Mad，羟基积雪草苷）可以在体外促进脆弱拟杆菌的生长。随后通过实验明确，Mad对UUO小鼠的肾脏保护作用是肠道微生物依赖性的。口服Mad后，UUO小鼠中原本减少的脆弱拟杆菌得以恢复。

在腺嘌呤诱导的肾损伤模型中进行验证：研究者在腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中的验证了脆弱拟杆菌、1,5-AG或Mad均可以改善肾脏功能。研究发现腺嘌呤诱导的CKD小鼠中SGLT2表达下降，而口服活性脆弱拟杆菌可以显著提高SGLT2的表达量。此外，口服活性脆弱拟杆菌和1,5-AG可以降低腺嘌呤诱导的CKD小鼠血清和粪便中的脂多糖（LPS）的含量。总体来说，脆弱拟杆菌、1,5-AG和Mad可以缓解腺嘌呤诱导的CKD小鼠的肾脏纤维化。

在一些研究中，联合多组学标志物组合被发现比单一组学的生物标志物（组合）有更好的分类性能。在这类研究中，一般先描述两组学各自的分子特征（同简单研究思路），再进一步进行单组学和两组学联合的生物标志物分析（可选择一种或多种机器学习方法）。最后，通过比较单组学和多组学的生物标志物区分或者分层的性能，得出最终结论。

血清整合多组学揭示人类糖尿病肾病的多分子特征

Serum integrative omics reveals the landscape of human diabetic kidney disease

期刊：Molecular Metabolism

影响因子：8.568

PMID：34737094

糖尿病肾病(DKD)是II型糖尿病(2- DM)最常见的微血管并发症。目前，尿液和肾脏活检标本是诊断DKD的主要临床资源。本研究通过蛋白质组学和代谢组学检测及基于机器学习的生物标志物分析，全面评估了血液在监测DKD发病中的诊断价值。

（1）研究设计：

蛋白质组学：人血清，健康对照（HC，n=30）、II型糖尿病（2-DM，n=30）、早期糖尿病胃病（DKD-E，n=30）、晚期糖尿病胃病（DKD-A，n=30）

代谢组学：人血清，健康对照（HC，n=441）、 II型糖尿病（2-DM，n=446） 、早期糖尿病肾病（DKD-E，n=121） 、晚期糖尿病胃病（DKD-A，n=94）

（2）研究结果：

蛋白质组学：共定量了1187 种蛋白质，经数据预处理和缺失值过滤后使用581种蛋白质进行后续分析。47个蛋白在4个组别中发生持续的改变。IPA分析（ Ingenuity pathway analysis）显示，差异蛋白质参与肝X 受体/类维生素 X 受体(LXR/RXR) 激活、法尼醇 X 受体/类维生素 X 受体 (FXR/RXR) 激活和急性期反应信号传导。研究者挑出8个蛋白在样本中进行了验证。

基于蛋白质组学的生物标志物分析：研究者使用五折交叉验证法和4种机器学习算法——LDA（线性判别分析）、SVM（支持向量机）、RF（随机森林）和Logi（逻辑回归） 最终明确前述8个蛋白中的3种蛋白质——a2-M、组织蛋白酶D和CD324是监测DKD进展的潜在有价值的生物标志物panel。然而，这些蛋白质仍然无法准确区分2-DM和DKD-E。

代谢组分析结果：共定量了349个代谢物，经数据预处理和缺失值过滤后，对207个代谢物进行后续分析。研究者对不同组间的代谢物进行了差异比较分析。差异代谢物的KEGG富集分析显示，甘油脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化以及半乳糖代谢是受影响最大的途径。

基于代谢组学的生物标志物分析：研究者使用五种机器学习算法——LDA（线性判别分析）、SVM（支持向量机）、RF（随机森林）、Logi（逻辑回归） 和PLS-DA（偏最小二乘判别分析） 寻找可以区分不同疾病的标志物。与蛋白质标志物情况类似，代谢物也无法清楚地区分 2-DM与DKD-E。

两组学联合标志物分析：研究者整合蛋白质组学和代谢组学进行通路分析，并确定了几种通路：半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化、柠檬酸循环和丙酮酸代谢。研究者将这几个通路中的蛋白质和代谢物作为输入，分析蛋白质+代谢物的联合生物标志物组合是否能更准确的诊断疾病的不同阶段。五个机器学习模型的结果表明，蛋白质+代谢物的生物标志物组合模型相比于单一组学的生物标志物组合提高了 DKD 预测的准确性和稳定性。

吉凯基因提供转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术服务，并提供完善的多组学整合分析，欢迎各位老师咨询。