血管成像 | 斑马鱼幼体在短波红外波段的光学透明度和无标记血管成像作为心血管系统发育长期研究的工具

2023-04-06 12:43:03, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：利用光学技术对早期发育阶段的斑马鱼心血管系统进行无创分析时，主要基于传统光学显微镜元件和图像传感器，采集和分析的光的波长范围在400-900 nm范围内。本文比较了使用可见光和近红外范围(VISNIR) 400-1000 nm和短波红外范围(SWIR) 900-1700 nm的无创光学方法。在这些波长范围内测量斑马鱼组织的透射光谱，然后根据VISNIR和SWIR的数据计算血管图、心率和血流速度。SWIR中记录了更高的色素图案透明度，而在此范围内的心脏和血管检测质量不低于VISNIR。所获得的结果表明，SWIR成像用于监测斑马鱼胚胎和幼虫的心脏功能和血流动力学分析的效率更高，并表明与其他受色素模式发育限制的光学技术相比，SWIR成像可支持更长的实验计划。

背景：斑马鱼(Danio Rerio)是一种小型鲤科鱼类，是研究脊椎动物包括人类疾病各种过程的最常见的模式生物之一。在过去的几十年里，由于其基因组中存在人类疾病基因和胚胎的光学透明度，斑马鱼一直被积极地用于模拟心血管病理。光学方法是对早期发育阶段的斑马鱼心血管系统进行非侵入性研究的最常见方法。在斑马鱼模型中，这些技术被用作检查先天性心脏病、心肌病以及各种因素对心血管系统功能的影响的工具。此外，透明的斑马鱼胚胎可以用于研究心血管表型以及血流动力学与癌细胞迁移能力的关系。

如今，光学相干层析成像使斑马鱼内部的微米分辨率可视化成为可能。当其与光声学、血管造影术或其他成像手段相结合时，是识别和研究特定组织的可靠工具。共聚焦显微镜和光片显微镜提供了斑马鱼心脏和血管的更详细的结构，但需要长期扫描和血细胞标记。染料的荧光可以进行准确的高对比度心血管成像。没有这两种显微镜及染料，就需要大量的图像分割和分析算法。无标签且经济实惠的心跳测量和血管测绘的光学方法主要基于时差分析，也就是说在显微镜明场图像中跟踪与血液脉动相关的时间变化。

光学技术在可见光下的一个重要限制，来自于色素图案的形成导致的胚胎透明度降低。野生型斑马鱼中黑色素细胞的定位和转变，将使用光学方法的长期实验计划限制在在受精后1-2周。过去开发了1-苯基-2-硫脲的应用和基因组干预的方法，以达到在更长时间内保持斑马鱼胚胎透明度的目的，但基因组干预或化学试剂的应用可能会影响实验结果。此外，实验计划可能建议只使用野生斑马鱼。因此，允许忽略黑色素细胞的光学方法的发展，关系到斑马鱼胚胎和鱼类胚胎模型的应用。

SWIR(900-1700 nm)的光学技术是克服这一问题的方法之一。该范围内的光具有减少散射和在生物组织中具有更高穿透深度的优点。SWIR相机的上市使多种高灵敏度成像方式成为可能。本文通过实验证明了斑马鱼组织在SWIR中的光学透明度比在VISNIR中的高，SWIR成像可以更有效地进行典型的心血管成像观察。

Figure 1

这项研究包括两个阶段(图1)。第一个阶段的目的是测量斑马鱼组织的光谱特性，并证明SWIR在光学透过率方面比VISNIR具有潜在的优势。在第二阶段，我们通过计算血管地图、心率和血流速度，定量比较了VISNIR和SWIR对心血管系统的表征。

Figure 2

首先是光学透明度测量。图2a和2b显示了眼睛、卵黄、肌肉、心脏和耳石的VISNIR(400-900 nm)和SWIR(900-1700 nm)图像，这些器官具有不同的结构和特性。本文手动选择与它们相关的区域(图2c中的彩色阴影区域)并标记颜料图案，以查看其在VISNIR中的弱透明度在SWIR中是否有所不同。通过在显微镜照明系统中安装窄带滤光片，获得了15幅斑马鱼麻醉后的光谱图像，计算了选定器官I(λi)(i=1，2，…，15)和无标本背景B(λi)的平均强度随波长的变化关系，并计算了T(λi)=I(λi)/B(λi)的透射谱。图2d显示了超过5个样本的平均箱线图T(λi)。由于图2d中灰色垂直条纹所示的1450 nm附近的高吸水率，认为该波长带内的T(λi)的值是不可靠的，因此跳过它。图2d中显示的数据清楚地表明，在SWIR中，所有斑马鱼器官的光透过率T(λi)增加了1.5-2.5倍。肌肉、卵黄、心脏和色素皮肤在850-1600 nm的整个范围内始终保持70%-90%的透明度。

Figure 3

接着进行心血管研究，首先是血管成像研究。图3展示了斑马鱼身体的典型VISNIR和SWIR图像。一旦原始序列的图像被匹配，通过视频毛细血管镜即可计算血流图，即通过突出显示强度变化对应于心脏活动的像素来计算强度变化的二维分布和血管图像。从VISNIR图像（上行）中检测严重色素沉着区域的血管几乎是不可能的。在图3所示的个体中，标有黄色的色素图案覆盖了大部分的主静脉和部分节段动脉，这就导致在重建的血管图像中没有这些血管（图3b上行）。而在SWIR图像中，该色素是透明的（图3a下行），因此几乎不影响SWIR图像处理算法的血流检测能力。从SWIR系列图像重建的血管图显示了更详细的血管结构，包括那些被色素沉积图案隐藏的血管（图3b下行）。

Figure 4

收集8张重叠20%-30%的图像，计算血管地图，并将它们拼接成无缝全景图，在VISNIR和SWIR中获得整个动物的高分辨率血管图像(图4)。在SWIR全景图(图4b)中，可以在头部、身体和尾部看到多条血管，这些血管在VISNIR(图4a)中是不存在的。同样，由于SWIR的透明度，鱼全身的色素沉着几乎不会影响光学测量。

Figure 5

其次是心率的测量。心率是心脏功能和整体健康的主要指标。它的测量最直接的方法之一是光体积描记术(PPG)，即跟踪血液循环的体积变化。本文在VISNIR和SWIR中实现了这种心率测量方法。本文选择了心脏区域(图5a中用彩色框突出显示)，并计算了其平均强度的时间依赖性（图5b）。在减去低频分量之后，得到可以分析和比较的归一化PPG信号(图5c)。实验表明，VISNIR和SWIR成像都能提供清晰稳定的周期性PPG信号。虽然VISNIR中的心跳信号的幅度是VISNIR的4-5倍，形状更详细，但这两种信号都很适合心率测量。在图6所示的例子中，用VISNIR和SWIR测量的心率分别为161次/分和164次/分。这些值与过往研究中获得的数据接近。

Figure 6

最后是血流速度的测量。血流速度是定量描述心功能和了解心血管血流动力学至关重要的参数。图6a显示了在VISNIR和SWIR中获取的斑马鱼身体的原始图像。选择了大动脉(红色)和主静脉(蓝色)的区域(见图6a和6b)，通过检测这些血管的中心线并计算每个点的法线，将它们的轨迹转换为直线，并跟踪相邻图像之间的相对位移，血流速度即可以计算为该位移和50赫兹的帧速率的乘积。在VISNIR中，色素沉着的图案几乎完全覆盖了大静脉(见图6a)。因此，血流速度的检测和分析只有在短波红外中才是可行的。图6b显示了腹主动脉和主静脉血流速度的时间依赖关系。腹主动脉和基底静脉信号的相移、形状、速度值(VISNIR：576±450μm/s，SWIR：574±510μm/s和564±112μm/s)以及其他特征与用其他方法获得的数据很好地吻合。同时还可以通过简单的频率分析从这些信号中提取心率。在图6所示的例子中，VISNIR为161 bpm，SWIR为164 bpm。这些值与从心脏区域的PPG信号获得的值一致(图5c)。

Table 1

Table 2

表2总结了与在VISNIR和SWIR中对两种斑马鱼4 dpf胚胎进行的心血管研究相关的量化数据。PPG信号的信噪比(SNR)反映了心脏活动测量的可靠性。血管密度被定义为与检测到的血流的血管相关的像素与样本占据的总像素量的比例。表2中的量化数据显示了SWIR心血管研究相对于传统VISNIR成像的优势。由于斑马鱼器官的透明度和色素沉着，SWIR图像的处理在血管测绘和血流速度测量方面更具信息量和可靠性。

讨论：本文对VISNIR和SWIR成像的评估显示，SWIR中的斑马鱼组织的光学透过率显著增加，色素图案更透明。同时，在此范围内获得的图像的心脏和血管检测质量不逊于VISNIR。

SWIR成像允许将野生型斑马鱼的成像周期延长2-3周，并放弃遗传或生化操作以增加组织透明度。这种方法可用于在斑马鱼模型中建立复杂的长期实验计划（例如，在研究药物的药效学、药物和异生素的延迟效应和生物蓄积、血液中循环肿瘤细胞的转移动力学等）。

斑马鱼是目前生物医学实验中最受欢迎的鱼类。如今，硬骨鱼中的一些其他鱼类被探索来模拟人类疾病。由于鱼类的早期发育的相似性，SWIR成像很有可能作为非侵入性光学方法，在大多数硬骨鱼的早期发育阶段用于研究其心血管功能和血管造影。

结论:与VISNIR相比，斑马鱼组织及其色素图案在SWIR中表现出更高的透明度。这一发现扩大了光学技术用于心血管研究的范围，如监测心脏活动和血流成像。即使在存在色素的情况下，SWIR成像也可以对位于色素后面的血管进行非侵入性测绘和量化。这项研究的结果可能会提高多种光学技术(光体积描记、光学相干断层扫描、高光谱成像等)的效率，同时这些光学技术被广泛应用于研究斑马鱼的发育动力学和紊乱。

参考文献

Volkov, M.; Machikhin, A.; Bukova, V.; Khokhlov, D.; Burlakov, A.; Krylov, V., Optical transparency and label-free vessel imaging of zebrafish larvae in shortwave infrared range as a tool for prolonged studying of cardiovascular system development. Sci Rep 2022, 12 (1), 20884.

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