2023-03-28 15:08:11, 东单ClinChem SCIEX
近年来,液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)在临床检验领域受到广泛关注。该技术具有特异度高、可同时区分定量多种代谢物等特点,正逐渐从科研应用走向临床实践前沿。
北京协和医院检验科邱玲团队自2012年开始筹建临床质谱实验室,至今已开展儿茶酚胺及其代谢物、25种类固醇激素、极长链脂肪酸等近80余种临床检测项目,对嗜铬细胞瘤及副神经节瘤、先天性肾上腺皮质增生、肾上腺脑白质营养不良等疾病的诊断及鉴别诊断提供了巨大帮助。
前期,本实验团队基于免疫方法检测胃泌素结果与临床不符的问题出发,建立了国内外首个使用LC-MS/MS测定测定胃泌素两种亚型G34和G17的方法(Clin Chem. 2021 Sep 1;67(9):1220-1229),从对小分子代谢物的检测,向大分子蛋白及多肽的质谱测定迈出了新的一步。但是该方法基于传统固相萃取方法,前处理手工操作环节繁琐,对人员操作的技术能力要求更高,限制了该技术在更大范围的推广应用。为了推进LC-MS/MS技术的自动化,邱玲团队马晓丽等人首次开发出基于磁珠固相萃取技术同时提取G34、G17以及其硫酸化形式的方法,并发表于国际分析化学检验Top期刊《Analytical Chemistry》
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背景介绍
在采用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)进行生物样本检测时,当目标分析物具有显著不同的性质时,通常需要联合使用不同类型的固相萃取(SPE)板重复提取过程,导致低通量和过多的人工、材料和样品消耗。在本研究中,我们开发并验证了一种可行且高效的方法,可以在一次操作中富集不同性质的目标分析物,同时充分消除基质干扰,以满足LC-MS/MS的要求。
研究方法
本研究以胃泌素测定为研究对象,开发了一种自动的磁珠顺序提取(MBASE)工作流程(图1),同时从人血清中提取非硫酸化胃泌素-17 (G17ns)、硫酸酸化胃泌素-17 (G17s)、非硫酸酸化胃泌素-34 (G34ns)和硫酸酸化胃泌素-34 (G34s)四种不同性质的化合物。与传统的固相萃取工艺相比,MBASE工作流节省了75%以上的时间和人工费用,90%以上的材料成本,同时提供了更高的萃取效率。
图1 磁珠顺序提取(MBASE)工作流程示意图
研究结果
1、LC-MS/MS法的总运行时间为7分钟。MBASE提取G17s,G17ns,G34s和G34ns及其内标的典型色谱图如图2所示。
图2 血清样本G17s,G17ns,G34s和G34ns及其内标的典型色谱图
2、本方法的回收率
MBASE提取G17s、G17ns、G34s和G34ns的回收率结果如表1所示。G17s、G17ns、G34s和G34ns的回收率分别为84.0%~111.0%。
表1 MBASE提取G17s,G17ns,G34s和G34ns的回收率
3、本方法的精密度
MBASE提取G17s,G17ns,G34s和G34ns的批内不精密度分别为3.2%~10.6%,总不精密度分别为7.0%~12.4%。
表2 MBASE提取G17s,G17ns,G34s和G34ns的精密度
4、SPE LC-MS/MS和MBASE LC-MS/MS方法比较
SPE LC-MS/MS测定的四种胃泌素浓度与MBASE LC-MS/MS进行比较,相关系数(r)为0.986–0.994,斜率为0.97–1.07,截距为−0.86–5.14, 两种方法的测定的偏差较小(−0.8–41.9)(图3)。
图3 SPE LC-MS/MS和 MBASE LC-MS/MS测定血清中G17ns、G17s、G34ns、G34s的方法比对
5、CLIA和MBASE LC-MS/MS方法比较
CLIA测定的四种胃泌素浓度总和与MBASE LC-MS/MS进行比较,相关系数(r)为0.798,斜率为0.25,截距为72.90, 两种方法的测定的浓度偏差较大(图4)。
图4 CLIA和 MBASE LC-MS/MS测定血清中胃泌素浓度的方法比对
结论
我们首次成功开发并验证了自动化MBASE前处理方法,以同时准确地确定人血清中四种性质不同的胃泌素-G17ns, G17s, G34ns和G34s的浓度。与固相萃取方法相比,该方法显著提高了样品制备通量,同时减少了时间和耗材成本。MBASE LC-MS/MS方法被证明是分析人血清中胃泌素谱的理想替代方法,将为胃泌素瘤的诊断提供帮助。
北京协和医院检验科是国家临床重点专科建设项目,在2012年购入第一台液相色谱串联质谱仪,2018年后陆续购入多台高灵敏度液相色谱串联质谱仪,质谱平台进入快速发展期。
目前拥有液相色谱串联质谱仪(AB Sciex 4500MD、AB sciex 4000Qtrap、AB Sciex QTRAP 6500+、Waters Acquity UPLC I-Class xevo TQ-S、Waters Acquity UPLC I-Class xevo TQ-XS)、英盛生物YS EXACT 9900MD,电感耦合等离子体质谱仪(Thermo iCAP Q、YS EXT 8600MD),离子色谱等仪器。质谱技术作为检验领域较为前沿的技术,正在从基础研究走向临床检测。目前拥有6名精通质谱技术的研究人员、技术人员、研究生及博士后,具有丰富的方法开发经验。
目前基于该平台,进行了大量的科研及临床转化工作。目前已在Clinical Chemistry 、Clinical Chemistry and Laboratory Medicine、Journal of Chromatography B, Clinica Chimica Acta、中华检验医学等检验医学领域有影响力的期刊发表19篇质谱方法开发的文章(SCI 13篇),22篇基于质谱技术的应用类文章(SCI 15篇),申请专利10余项,已获授权专利四项,同时将所建立的方法转化为临床应用,目前已在临床开展25羟基维生素D2&3、维生素A/E、极长链脂肪酸、血清碘及尿碘、儿茶酚胺及其代谢物、类固醇激素等80余种检测项目,已测定临床样本10万余例。
2023年伊始,为进一步推动学科高质量发展,检验科将质谱与电泳等特殊项目检测平台从生化免疫组独立,成立质谱与特检组,针对临床需求强烈、常规检测方法无法测定或测定有问题的项目进行重点攻关,以进一步提高特色项目检测能力,推动临床服务能力持续提升。
未来,质谱与特检组将继续积极开展与临床的密切沟通,参与多学科会诊,并利用协和医院内分泌科、神经科、血液科等科室的雄厚临床资源,探索复杂结果解释,参考区间建立,临床路径优化等一系列特色检验项目临床应用中面临挑战的解决之路。积极参与仪器、设备、试剂的开发,也期待与业内质谱领域前沿团队交流、学习和合作,共同推进质谱等技术在中国的临床应用。
· 第一作者 ·
马晓丽 博士后
中国医学科学院
北京协和医院
检验科
主要研究方向:质谱技术在临床检验诊断中的应用,阿尔茨海默症生物标志物研究
科 研:以第一/共同第一作者发表SCI文章10余篇,部分文章发表在Analytical chemistry、Journal of Natural Products、Bioorganic Chemistry、Acta Pharm Sin B、Clinical Chemistry等杂志。主持国自然基金一项:基于磁珠联合质谱法测定脑脊液中Tau蛋白在阿尔茨海默症分级及早期诊断中的应用
· 通讯作者 ·
禹松林
助理研究员
中国医学科学院
北京协和医院
检验科
质谱与特检组组长
主要从事液相色谱串联质谱方法的建立及临床常规应用
主持建立维生素D、维生素A和E、血儿茶酚胺及其代谢物、极长链脂肪酸、类固醇激素等质谱方法并用于临床检测。主持国家自然科学基金青年项目、北自然面上项目各1项,授权国家发明专利2项,发表中英文文章六十余篇,其中以第一(共一)及通讯作者发表SCI及核心论著四十余篇。
邱玲
研究员、教授、
博士生导师
中国医学科学院
北京协和医院
检验科副主任
现担任中国老年医学学会检验医学分会副会长、中华医学会检验分会生化学组委员、北京检验分会常委、CNAS 医学实验室认可主任评审员、国家卫生标准委员临床检验标准专业委员会委员等社会职务。
主持国家自然科学基金、首发基金重点项目、科技部重点支撑子项目等共17项。以第一作者、通讯作者发表SCI论著90余篇(IF>300分)、核心期刊论著100余篇。获省级科技进步二、三等奖各一项,授权发明专利11项(欧洲专利2项),牵头体外诊断产品注册试验60余项。
文/马晓丽
编辑/孙丹丹
审校/禹松林、夏良裕、邱玲
监制/陈雨
END
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