iScience | 上海药物所黄河团队揭示HBO1是哺乳动物细胞苯甲酰化修饰的“Writer”

景杰生物 | 报道

赖氨酸苯甲酰化 (Kbz) 是一种含有苯环的酰化修饰，由芝加哥大学的赵英明教授于2018年首次报道[1]。Kbz主要发生在组蛋白的N-末端尾部，其修饰基团较大（是乙酰化的2倍），且有较强的疏水性（是乙酰化的3倍），这表明Kbz相较于乙酰化修饰具有更加显著的结构影响力和基因调控作用。

关于Kbz的调控酶目前已有一定的报道，如赵英明教授团队报道在人肝细胞癌细胞HepG2中鉴定出苯甲酰化修饰的去修饰酶（Eraser）SIRT2 [1]，后续李海涛教授课题组报道DPF家族和YEATS家族是人组蛋白苯甲酰化修饰的识别蛋白（Reader）[2]，最近的陈勇和彭超研究团队通过遗传、生化和结构分析等研究手段鉴定到酿酒酵母中Kbz的修饰酶(Writer) Gcn5、去修饰酶Hst2和识别蛋白Taf14和Sas5 [3]。然而，在哺乳动物细胞中催化Kbz的修饰酶仍然未知。此外，非组蛋白Kbz底物可能存在于哺乳动物细胞中，但这些蛋白目前仍不清楚。因此这些研究空白也阻碍了Kbz的进一步功能研究。

近日，中国科学院上海药物研究所黄河团队在iScience 上发表了题为“HBO1 catalyzes lysine benzoylation in mammalian cells”的最新研究成果[1]。该研究鉴定并验证了赖氨酸乙酰转移酶(KAT) HBO1为哺乳动物细胞中Kbz的“Writer”，并通过Kbz修饰组学鉴定出HBO1调控的底物蛋白，揭示了HBO1在细胞生理学中的非经典酶活性和功能。华东师范大学翁杰敏教授参与了该研究，景杰生物为该研究提供了Kbz泛抗体和Kac泛抗体（Anti-Benzoyllysine Rabbit mAb，PTM-761; Anti- Benzoyllysine antibody, PTM-763；Anti-Acetyllysine Mouse mAb，PTM-101）。

赖氨酸乙酰转移酶(KAT)除了催化Kac以外，还表现出催化其它赖氨酸酰化修饰的功能。因此，作者猜测可能存在一些KATs也具有苯甲酰转移酶活性。为了验证这一假设，作者以苯甲酰辅酶A和人工合成的人组蛋白H3或H4肽分别作为辅因子和底物，进行基于荧光法的体外KATs催化酰化试验，筛选出8个KATs，分别为MOF、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、GCN5、PCAF和HAT1。只有HBO1和HAT1对Kbz表现出显著的催化活性。

图1 Kbz转移酶的体外筛选

为了评估HBO1和HAT1在细胞中的苯甲酰转移酶活性，作者在HeLa细胞中过表达多种KATs并进行了Kbz免疫荧光(IF)染色。鉴于p300和CBP的广泛酰基转移酶活，作者也将它们纳入分析。不出所料，这些KATs的过表达导致了Kac的大幅增加。但是只有在过表达HBO1、p300和CBP的细胞中，Kbz水平才会显著升高。进一步地，为了确定HBO1、CBP和p300在细胞中的Kbz转移酶活性，作者在293T细胞中过表达这些蛋白，并通过WB检测组蛋白H3的Kbz水平。与IF结果一致，WB分析显示HBO1、p300和CBP的过表达导致组蛋白Kbz水平升高。值得一提的是，p300和CBP在细胞中能够催化Kbz并不奇怪，因为它们的催化口袋足够大，可以容纳不同的酰基辅酶A。综上所述，这些结果表明HBO1可以在体外和哺乳动物细胞中催化底物蛋白发生Kbz修饰。

图2 在哺乳动物细胞中对候选Kbz转移酶进行评价

接着，为了研究HBO1是否在哺乳动物细胞中调控非组蛋白的Kbz，作者在293T细胞中过表达HBO1，并检测细胞整体Kbz水平的变化。结果表明，过表达HBO1可提高非组蛋白和组蛋白的Kbz水平，揭示Kbz转移酶活性确实是HBO1特有的。此外，作者通过分子对接预测了苯甲酰辅酶A可以通过氢键相互作用与HBO1的Thr477、Ile475、Leu511、Ser512残基相互作用，并且一个由Val472、Pro507、Pro510、Leu511和Gly515组成的大的疏水口袋可能通过疏水相互作用进一步稳定苯甲酰基团。

图3 HBO1在体外和哺乳动物细胞中都能催化Kbz

鉴于HBO1在哺乳动物细胞中介导Kbz，于是作者想进一步了解清楚HBO1到底靶向了哪些Kbz蛋白底物和细胞过程。为此，作者使用WT和HBO1过表达的293T细胞进行了Kbz定量修饰组学分析，总共鉴定到1747个Kbz位点，其中1344个位点可进行定量，77个位点发生显著上调。有趣的是，H4K8bz和H3K14bz分别增加了292.8倍和63.9倍，这表明HBO1可能通过调控H4K8bz和H3K14bz发挥表观遗传功能。此外，对HBO1靶向的Kbz修饰蛋白质的GO生物过程富集分析表明，HBO1可能通过Kbz通路在巨核细胞分化、着丝粒染色质重塑和核小体组装中发挥重要作用。进一步地KEGG通路分析表明，这些Kbz修饰蛋白参与了酒精中毒、剪接体和脂肪酸代谢等过程。以上分析结果表明HBO1可能通过介导细胞整体的Kbz修饰来调节细胞的多种生理和病理过程，暗示了其巨大的研究潜力。

图4 HBO1介导的Kbz与多种细胞过程相关

综上所述，赖氨酸苯甲酰化(Kbz)的调节酶和底物蛋白在很大程度上仍然未知，阻碍了进一步的功能研究。该研究鉴定并验证了HBO1是哺乳动物细胞中Kbz的“Writer”，并报道了哺乳动物细胞中的苯甲酰化修饰全景图（包括1747个Kbz位点）。生物信息学分析表明，HBO1靶向的Kbz修饰蛋白参与了染色质重塑、转录调控、代谢、免疫调控、肿瘤进展等多种细胞生理和病理过程。过量摄入苯甲酸钠会提高Kbz水平并增加某些疾病的风险，例如运动协调障碍和ADHD症状。鉴于HBO1在哺乳动物细胞中充当Kbz转移酶，研究结果为这些疾病的治疗提供了一些新的见解。

图5 本研究的工作模式图

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参考文献：

1. He Huang, et al. 2018. Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2, Nature Communications.

[2] Xiangle Ren, et al. 2020. Histone benzoylation serves as an epigenetic mark for DPF and YEATS family proteins. Nucleic Acids Research.

[3] Duo Wang, et al. 2022.Global profiling of regulatory elements in the histone benzoylation pathway. Nature Communications.

[4] Doudou Tan，et al. 2022. HBO1 catalyzes lysine benzoylation in mammalian cells. iScience.

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