“药”说丨天然产物中5α-还原酶抑制剂的高效筛选

良性前列腺增生 (BPH) 是一种常见的男性泌尿系统疾病，多发于中年。其发病机制尚不完全清楚，但大量研究已经证实5α-还原酶活性与之密切相关。

5α-还原酶可将睾酮转化为双氢睾酮 (DHT)，双氢睾酮结合雄激素受体的能力比睾酮更强。当双氢睾酮异常或过量存在，会过度刺激前列腺细胞的分化和增殖，进而导致男性泌尿系统疾病。在5α-还原酶的作用下，还可能导致其他与雄激素相关的疾病，如痤疮、雄激素性脱发、前列腺癌等。

临床上对前列腺增生的治疗主要有手术和药物两种。手术可能会给患者带来心理压力，术后4-5年仍可能出现排尿困难、血尿等症状。更糟糕的是，若前列腺特异性抗原 (PSA) ≥ 0.2 ng/mL，可能导致前列腺癌。治疗药物主要有3大类：5α-还原酶抑制剂；α-受体阻滞剂；植物制剂以及中药；单独或联合应用。

常用5α-还原酶抑制剂有非那雄胺、度他雄胺等，但它们也有一些副作用，包括睾丸疼痛、射精异常、疲劳、贫血等，以及 Gleason 评分高 (7-10分) 的患者在长期服用后会增加肿瘤生长的风险。因此，寻找疗效强、副作用少的新型天然抑制剂很有必要。

目前药物开发中筛选5α-还原酶抑制剂的方法包括 HPLC 和 HPLC-MS 等。HPLC 存在灵敏度低、可检测物质范围窄等局限性；HPLC-MS 更适合高通量筛选，但需要花费更多时间优化仪器方法、样品前处理等。因此，开发一种简单的策略，更高效、更快速地筛选潜在候选药物具有重要意义。

基于芯片的多通道纳喷离子化技术，有着快速、高效、高灵敏、全自动、可持续进样等特点，在不同研究领域得到了广泛应用。诸如，人雌激素受体 α 亚型配体结合区 (hER-αLBD) 非共价结合的研究、干血斑 (DBS) 中α-半乳糖苷酶活性的测定、二维凝胶样本分析、复杂混合物中碳水化合物成分的测序、环境污染物相关酶促反应的测定、肽段以及自上而下的蛋白质测序和鉴定，等。

上海中医药大学杨莉研究员课题组创新性地利用基于芯片的多通道纳喷离子化技术与质谱联用 (nano-ESI-MS) 作为5α-还原酶抑制筛选的工具。与传统技术相比，该方法简化了样品前处理步骤，避免了交叉污染和样品残留，大大提高了实验效率。

初步数据表明，姜黄素 (一种天然的抗炎化合物) 能够明显地抑制5α-还原酶的活性。该方法结果与 HPLC-MS 一致，表明 nano-ESI-MS 可以作为一种药物开发中快速、高通量的药物筛选策略，在生物医学分析中有广阔应用前景。

本研究利用 TriVersa NanoMate / LESA 芯片多通道纳喷源 (Advion) 联接 LTQ XL 线性离子阱质谱仪进行类固醇激素测定。用乙酸乙酯从细胞培养物中提取类固醇，通过384孔板直接注射，进样量 10 μL，所用的芯片孔径为4 μm。

筛选实验分为空白对照组 (BK)、度他雄胺组 (DD)、非那雄胺组 (FD) 和样本组。每组添加50 μM 睾酮作为底物和250 μM NADPH。空白组不单独加药。DD 组和 FD 组分别添加不同浓度的度他雄胺和非那雄胺 (1 μΜ 和 5 μM)。6 h 后加入睾酮-d3 (10 ng/mL) 作为内标物，用200 μL 乙酸乙酯提取。最后，通过 LESA-MS 分析样品。

使用基于芯片的多通道纳喷技术进行 5α-还原酶抑制剂的筛选实验。在50多种天然化合物和提取物中，姜黄素具有更好的抑制作用。度他雄胺和非那雄胺作为阳性对照组。图 3c 显示了四组中 DHT 相对含量的变化：空白对照组 (BK)、度他雄胺组 (DD)、非那雄胺组 (FD) 和姜黄素组 (CC)；CC 组加入三种不同浓度 (5μM、25μM、50μM) 的姜黄素。给药组 DHT 的相对量显著低于空白对照组，而且随着药物浓度的增加，DHT 的相对含量也有所下降。该药物有效地抑制了5α-还原酶的活性，从而减少了睾酮向 DHT 的转化。此外，其他四种化合物对5α-还原酶也有轻微的抑制作用。

有趣的是，实验结果显示睾酮的变化量与 DHT 的变化量不同。这表明抑制剂不仅影响睾酮和 DHT 的变化，还可能影响另一途径中的激素变化。推测它们可能会促进睾酮转化为其他类固醇激素，或影响某些途径中的其他酶，其依据是度他雄胺的副作用也与激素分泌密切相关。

本研究首次将一种基于芯片的多通道纳喷离子化技术用于5α-还原酶抑制剂活性药物的筛选，且方法快速、高效。9种不同类型的类固醇激素很容易被检测到，表明该方法可用于生物液体样品中甾体激素的测定。使用该方法从中药中筛选出了姜黄素等5种对5-还原酶有抑制作用的成分。这些活性成分也可能通过其他途径影响酶活性，进而影响其他激素。所得数据与常规的 HPLC-MS 分析结果一致。

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