让细胞培养远离浸出物影响

2023-02-17 23:34:52, 赛多利斯德国赛多利斯集团

由于细胞容易受到细胞处理的物理方式及用于培养物接种及填充的实验室设备带来的影响，因此在细胞培养应用中应避免塑料实验室用具产生的浸出化合物。赛多利斯移液器多款吸头释放的浸出物含量极低，即使在苛刻的酸性或溶剂条件下也远低于能够对细胞健康或生物测定产生影响的水平。

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下载本篇《细胞培养技术和实验室耗材在确保最佳细胞健康中的重要作用》应用说明，了解赛多利斯移液器吸头低浸出物含量对细胞培养过程的重要作用。

细胞培养应用在研发过程中发挥着至关重要的作用。然而，许多因素都会影响体外培养细胞的健康，其中包括从用于细胞接种、补料和处理的耗材中的浸出物。浸出物是指在标准使用和储存条件下从塑料实验室耗材中释放出的化合物和微量金属。表1 中列出了的文献阐述了不同塑料浸出物对细胞生长、形态和功能的具体影响。

表1：浸出物及其对细胞培养的影响

考虑到这些风险，需要在细胞培养工作流程的每个步骤中尽可能减少可能存在的浸出物。为确保在细胞培养流程中细胞的健康，我们通过多种方法，测试了不同移液器吸头的表现。

测试的方法如下

移液器吸头的微量金属浸出物分析

将二次蒸馏浓缩的HNO3（100μL）吸入至200μL 赛多利斯Optifit 吸头、Safetyspace® 滤芯吸头和及其低吸附吸头型号中，保持5 秒钟，然后分配到酸洗样品管中。然后将排出的溶剂再次吸入至相同的移液器吸头，并分配到相同的酸洗样品管中。对每个移液器吸头重复该浸出循环共十次。使用超纯水将每个样品管中的溶液稀释至1N HNO3 浓度。使用ICP-MS，根据标准曲线分析样品。使用Nu AttoM SC-ICPMS对所有样品进行分析。使用1ppm的多元素亚组分溶液制备1000ppt、100ppt 和10ppt 标准品。在低分辨率模式下，在10个周期内进行500 次10ms 的扫描，在峰值跳跃模式下进行分析。

移液器吸头的浸出化合物分析

使用100μL 乙醇或二甲基亚砜清洗200μL Optifit 吸头、Safetyspace® 滤芯吸头及其低吸附型号，具体方法为将溶剂吸入移液器吸头，保持5 秒钟，然后直接分配到样品管中。使用多个相同类型的移液器吸头（五个移液器吸头，共500μL，混合样品）生成足以通过GC-MS 或LC-MS 进行化学浸出物分析的测试体积。

GC-MS

通过液- 液萃取制备乙醇和水提取物，并进样至Clarus 600GC-Clarus 600T MS Turbo 和C18 Elite-5MS（60m×0.25mm×0.25μm）色谱柱。通过使用内标2- 氟联苯（10μg/ml）进行液体注射，使用甲苯 -d8（ 0.1μg/ml）进行顶空注射，进行半定量。

LC-MS

将乙醇和DMSO 提取物直接进样至配有BEH C18(1.7 μm, 2.1 x 100 mm) 柱子的LC-MS 系统的Waters ACQUITY UPLCI-Class—Waters Xevo G2-XS QT。通过分别对空白样品与样品的基峰离子（BPI）色谱图，以及空白样品与样品的UV/VIS 色谱图进行目视对比，来进行筛选。

细胞培养

将小鼠 B16F10（ATCC® CRL6475™）细胞以不同密度接种在 96 孔板上，使用单道Picus® Nxt50-1000μL 移液器制备细胞系列稀释液（1:2 稀释）。使用 Picus® Nxt 5-120μL 和 10-100μLTacta® 移液器完成培养板接种（100μL/ 孔）。根据制造商的说明，在接种后 24 小时，采用基于甲瓒的分析测定细胞存活能力。在补充有 10% 胎牛血清和 100U/mL 青霉素链霉素Dulbecco 改良 Eagles 培养基中培养细胞。

基于上述方法得出如下结果

移液器吸头含有极少量的微量金属

表3 列出了由吸头制造商提供的一些微量金属浓度和检测限数据。根据表2 中的细胞毒性微量金属水平来评估这些浓度和检测限时，表3 中的某些值和检测水平显然超过了表2 中的细胞毒性值。在对比不同制造商的合格证书时，务必注意其中的检测水平和检测方法；微量金属测试限值应较低，并与金属可能的细胞毒性水平保持一致。

表2：金属的细胞毒性浓度示例

表3：赛多利斯和其他制造商移液器吸头的微量金属测试结果和检测水平示例（μg/mL=ppm）

浸出化合物的含量低于干扰水平

使用 GC-MS 对低吸附吸头中的对己二酸乙酯进行定量，最大浓度为 0.25ppm。检测到一种保留时间为 8.32 分钟的未知化合物，其最大浓度为 0.13ppm，但由于结构信息不充分，所以无法对其进行表征。未检测到超出其定量限的其他化合物（表 4）。

表4：赛多利斯移液器吸头化学浸出物

*低于定量限 †低于检测限

‡分析中没有样品的DiHEMDA 呈阳性，因此未确定 LOQ

赛多利斯低吸附移液器吸头
的安全性和耐用性

下图显示了一项研究结果，该研究比较了不同 LR 移液器吸头在低吸附性能稳定性方面的差异。用溶剂（异丙醇、丙酮或二甲基甲酰胺）清洗吸头 20 次，然后用水清洗三次。完成清洗步骤之后，通过测定移液后吸头中残留液体的量来测试吸附情况。使用赛多利斯低吸附吸头时，溶剂处理后的残留液体量始终较低。即使是标准（非 LR）赛多利斯移液器吸头，其表面吸附量也低于许多其他制造商生产的 LR 吸头。