项目文章 | 转录组学助力探究缺氧影响EV分泌的机制

缺氧是癌症微环境的基本特征之一，其与癌症的生存率呈负性相关，其中头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是实体肿瘤中缺氧最严重的类型之一。研究表明，在缺氧条件下，肿瘤细胞倾向于改变细胞外囊泡（EV）的数量和内容物，以调节肿瘤免疫抑制微环境的形成，从而促进肿瘤的进展，然而缺氧影响EV分泌的机制尚不明确。

2023年2月7日，上海交通大学医学院附属第九人民医院张建军研究员团队在Journal of Extracellular Vesicles（IF:17.337）期刊上发表了题为“ Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1α ” 的研究论文。本研究首次建立了一个低氧-溶酶体功能障碍- EV释放轴，从理论层面扩展完善了EV生物发生的机制框架，为后续调节EV作为治疗手段提供理论依据及数据支撑。

1、 缺氧促进EV分泌

为了分析缺氧对EV分泌的影响，首先通过EV标记物Alix、TSG101、Syntenin、Rab5和CD63证实了常氧和缺氧条件下（1% O2，48h）EV的蛋白标志物都具有特征性表达，同时通过透射电子显微镜验证了EV的直径大约100 nm，并表现出典型的杯形形态。随后通过检测EV的蛋白水平和纳米颗粒跟踪分析（NTA）发现，在缺氧条件下，EV分泌显著增加（图1）。

图1 缺氧促进EV分泌

2、缺氧通过抑制MVB与溶酶体的融合增加了内体系统衍生的EV分泌

进一步探究缺氧促进EV分泌的机制。发现在缺氧条件下，来自内体系统的EV数量显著增加，而以出芽途径产生的EV数量未见变化（图 2），表明低氧主要是促进了内体系统来源的EV释放。同时通过转录组测序发现，与常氧条件相比，缺氧细胞中内体分选复合物ESCRT-I、II、III和Vps4复合体的大部分亚基水平显著增加，表明缺氧增强了内体系统的货物装载活性。研究同时发现低氧改变了MVB（多泡体）的形态，其腔内囊泡（ILVs，EV的前体）的数量显著增加（图 2）。另外通过对Rab7和溶酶体标记物LAMP1共定位分析，发现缺氧阻止了MVB与溶酶体的融合（图 2）。综上表明，缺氧抑制了溶酶体与MVB的融合，导致内体系统来源的EV分泌增加。

图2 缺氧增加了内体系统衍生的EV分泌

3、缺氧通过破坏溶酶体的酸化而损害溶酶体功能

为了进一步探究溶酶体功能缺失对EV分泌的影响，采用NTA分析证实了巴菲霉素A1（Baf A1，v-ATPase抑制剂）处理肿瘤细胞24h后会显著增加EV分泌（图 3）。另外发现缺氧条件下，溶酶体的LAMP1、LAMP2、CTSB、CTSD蛋白酶的表达无论mRNA还是蛋白水平上变化均不显著，表明低氧对溶酶体的生成无显著影响；但是低氧会促进溶酶体向细胞外周扩散且体积明显增大（图 3）。此外发现缺氧会增加溶酶体pH值，破坏溶酶体内的酸性环境（图 3）。这些结果表明，缺氧通过破坏溶酶体腔内的酸性环境平衡、改变其亚细胞定位和体积大小，致使溶酶体功能受到损坏。

图3 缺氧损害溶酶体功能

4、ATP6V1A是溶酶体功能必需基因

V型ATP酶是维持溶酶体功能的核心分子。进一步研究发现，在缺氧条件下ATP6V1A表达受到显著抑制，ATP6V1A蛋白在全细胞裂解液和溶酶体裂解液中均明显下调，其下调后溶酶体环境PH值升高（图4）。同时发现在shATP6V1A细胞中，溶酶体的体积显著变大，MVB内的ILV密度高于对照组细胞，溶酶体与MVB的融合减少。当ATP6V1A被抑制时，EV的分泌水平显著增加（图4）。进一步探究ATP6V1A在缺氧条件下的功能，结果表明，外源性表达ATP6V1A可以增加LysoTracker染料强度，恢复因缺氧受损的溶酶体酸性环境，恢复溶酶体的正常体积（图5）；过表达ATP6V1A会减少每个MVB中ILVs的平均数量，可有效逆转缺氧条件下EV的分泌（图5）。综上所述，缺氧通过降低ATP6V1A表达破坏溶酶体的功能，促进EV释放，而重新表达ATP6V1A可以恢复溶酶体功能和降低EV的分泌水平。

图4 缺氧通过抑制ATP6V1A的表达而损害溶酶体功能

图5 ATP6V1A是溶酶体功能所必需的分子

5、HIF-α 负调控ATP6V1A表达

研究证实，ATP6V1A在mRNA和蛋白水平上均受到抑制，表明ATP6VA1可能在转录水平收到调控。结果显示，HIF-1α会导致ATP6V1A的表达下降（图6）。同时发现HIF-1α可以靶向结合ATP6V1A启动子的TATA box片段（图6）。HIF-1α过表达会显著抑制野生型ATP6V1A报告基因的荧光素酶活性，而HIF-1α结合位点突变的ATP6V1A报告基因可以消除HIF-1α的抑制作用，此外临床样本中也证实了HIF-1α与ATP6V1A呈负相关（图6）。综上所述，HIF-1α是ATP6V1A的转录因子，抑制ATP6V1A的表达。

6、HIF-α的积累会损害溶酶体，增加EV分泌

探讨在常氧条件下，HIF-1α积累对溶酶体稳态和EV分泌的影响，发现过表达HIF-1α，溶酶体的pH值增加，导致酸化失衡，溶酶体腔室扩大，MVB和溶酶体的融合减少（图7）。此外，HIF-1α过表达促进MVB中ILVs的形成，以及EV分泌（图7）。综上所述，HIF-1α可以增强HNSCC细胞中EV的分泌。

图7 HIF-1α积累会损害溶酶体，促进EV分泌

本研究阐明，在缺氧条件下，肿瘤细胞中HIF-1α的积累可以抑制溶酶体的重要成分ATP6V1A的表达，从而破坏溶酶体的酸性稳态平衡，致使溶酶体功能障碍，进一步减少溶酶体与MVBs的融合，最终增加EV的释放。研究不仅扩展了对低氧促进EV分泌的机制的理解，为ATP6V1A在肿瘤进展中的作用提供新的见解，更揭示了溶酶体稳态和EV分泌之间平衡的一种新的调节机制。

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面-头颈肿瘤科张建军研究员为文章通讯作者，李江教授和陈万涛教授为文章的共同通讯作者，王晓宁博士为文章第一作者，吴若怡和翟培淞为文章的并列第一作者。文章中转录组测序由上海欧易生物提供技术服务。

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排版人：小久

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