2023-02-09 17:55:55, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
小伙伴们,KingFisher这只厉害的翠鸟又来啦!
今天为大家带来的是KingFisher高通量自动化生物文库筛选方案。
噬菌体展示技术和SELEX技术是生物文库技术中最常用的两种技术,可以从大批量的初始文库中筛选出高特异性、高亲和力的目标分子。
噬菌体表面展示
1985年美国科学家乔治·史密斯开创性地提出了噬菌体展示技术,使得研究者可以像钓鱼一样从噬菌体文库中钓到能与靶标分子结合的展示了特定多肽的噬菌体。1990年格雷格·文特把噬菌体展示技术从多肽的展示与筛选扩展到抗体的展示与筛选,他们一起成为了2018年诺贝尔化学奖获得者之一。
图1. 2018年诺贝尔化学奖获得者,中:乔治·史密斯,右:格雷格·文特(图来源自网络)
噬菌体,就是能够感染细菌的病毒。而噬菌体表面展示,就是通过基因工程技术把一条基因片段插入噬菌体的衣壳蛋白基因中,这条基因片段生产出新的蛋白质或多肽,成为噬菌体外层的衣壳蛋白的一部分,在噬菌体表面“展示”出来,通过适当的淘选方法就可得到与靶标亲和性最强的可结合序列。
图2. 噬菌体展示的基因型和表型连接。
噬菌体表面展示技术已成为最重要的药物筛选平台之一,被广泛应用于疫苗、单抗研发等各个生物医药领域中。抗体药物的研发是其中最为令人瞩目的成就。
2002年,通过噬菌体展示技术成功开发了完全人源化的抗肿瘤坏死因子单克隆抗体——阿达木单抗,用于类风湿性关节炎和炎症性肠病等自身免疫性疾病的治疗,2017年的销售额高达180多亿美元,是目前世界上最为畅销的药物。
图3. 阿达木单抗(图来源自网络)
噬菌体表面展示的流程通常分为以下几步:
1.制备大量噬菌体展示文库,每个噬菌体表面展示一种特定的蛋白质或多肽。
2.噬菌体展示文库和靶标分子混合,捕获特异性结合的噬菌体。
3.用缓冲液洗去不能与靶标分子特异性结合的噬菌体。
4.将收集到的噬菌体侵染大肠杆菌进行进一步扩增,产生一个富集池作为新一轮淘洗的展示文库。
图4. 噬菌体展示技术示意图。
SELEX技术
Ellington、Tuerk等在1990年发明了一种基于核酸的高通量筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),使用大容量的人工合成随机寡核苷酸库,结合PCR体外扩增技术,指数级富集与靶标分子高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配体(aptamer)的方法。
和抗体相比,核酸适配体具有很多优势,如分子量小、生产成本低、存储和运输简单、无批间差异、可以快速放大、质控简单等,可广泛应用于生物传感器、肿瘤治疗、肿瘤检测、生物标志物的发现、抗病毒等领域。
2004年11月,由Eyetech与辉瑞公司共同研发生产的Pegaptanib (Macugen) 成为第一个获得美国FDA批准的抗血管内皮生长因子的核酸适配体药物,用于治疗老年性黄斑变性。
SELEX筛选通常需要进行5到16次淘洗,最终将得到的核酸适配体连入克隆载体,通过测序,毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)或者流式细胞技术进行评价。
图5. SELEX技术示意图。
KingFisher高通量自动化生物文库筛选方案
从方法上来说,噬菌体表面展示或SELEX技术遵循相同的迭代分离和扩增方案。
图6. 随机文库的一般筛选方案。
筛选轮数的数量取决于文库的多样性、靶标的亲和性、扩增的偏倚等。一般来说文库的多样性越大,找到高特异性和高亲和力的结合物的可能性就越大。
从绝大多数背景中分离出特定的结合物变得越来越困难。这是一项像大海捞针一样具有挑战性的任务。
解决这个问题的方法是通过连续的一系列淘洗和扩增来增加随机文库中特定结合物的数量,直到结合物被充分富集以进行克隆和验证。
多轮淘洗是一个耗时耗力的过程,通过什么方法能够加速抗体和核酸适配体的筛选呢?
Thermo Scientific™ KingFisher™
自动磁珠纯化设备
Thermo Scientific™ KingFisher™ Flex自动磁珠纯化系统是新一代自动化生物文库筛选平台,将手动筛选过程实现自动化。《抗体工程》2010版将KingFisher Flex作为自动化文库筛选标准化流程予以推荐。美国Recombinant Antibody Network成员也都采用KingFisher Flex进行自动化文库筛选。
优点:
● 自动化:快速平行处理96个样品,流程标准化
● 降低假阴性:磁珠法增加样本与标靶结合率
● 背景低:无需转移液体,无液体残留
● 提高重复性和一致性:淘洗条件可控
还有Thermo Scientific™ Kingfisher™ Duo Prime自动磁珠纯化系统,独特的双板位设计,连续利用2个96孔板,高达16个试剂位,轻松满足十几次清洗步骤,是中低通量自动化筛选的不二之选!
Invitrogen™ Dynabeads™磁珠
Invitrogen™ Dynabeads™磁珠用于体外诊断长达三十余年,是生物磁性分离的金标准,有超过五万篇文献的引用。链霉亲和素偶联的Dynabeads已广泛应用于各种手动和自动化操作领域,分离任何生物分子——只需加入生物素化的配体即可。
优点:
● 无需离心、沉淀或过滤
● 稳定且温和,保护了蛋白质的天然性质
● 绝对的一致性
● 最佳结合动力学和最少的样本损失,可实现定量分离
● 所有实验方案可轻松实现自动化
以核酸适配体的SELEX筛选为例:
1.靶蛋白包被。靶蛋白进行生物素标记后与链霉亲和素磁珠共孵育,通过磁性分离筛选获得靶蛋白链霉亲和素复合物。
2.DNA单链随机寡核苷酸文库制备。文库90℃变性,由于反向序列带有生物素标记,可以用链霉素标记的磁珠通过磁性分离去除。
3.筛选。DNA单链随机寡核苷酸文库与靶蛋白链霉亲和素复合物混匀孵育,通过洗涤之后,可以获得与靶蛋白分子相结合的核酸适配体。将核酸适配体洗脱下来作为模板,利用正向引物和生物素标记的反向引物进行扩增。90℃变性,用链霉素标记的磁珠去除反向链,得到核酸适配体。再进行混匀、孵育、结合、洗涤、洗脱这样5-16个循环。
4.将获得的核酸适配体连入克隆载体再进行评价。
图7.以Dynabeads链霉亲和素磁珠为载体的SELEX流程。
KingFisher 自动磁珠纯化系统和Dynabeads磁珠贯穿整个蛋白包被、单链文库制备、适配体筛选、克隆及验证四个部分,以实现核酸适配体筛选的自动化。
这种高通量自动化筛选方法快速、重复性好,极大缩短了筛选时间,最短10-15 天可完成筛选得到阳性克隆;同时,有良好的平行性,可同时进行多个靶分子筛选,提高通量及工作效率;转移磁珠的设计取代转移液体,充分洗涤降低非特异结合,减少假阳性;避免液体处理流程,减少实验室气溶胶的产生及交叉污染。
还等什么?让我们一起进入KingFisher的高通量自动化世界吧!
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