如何检测短寿命自由基？ 自旋捕获电子顺磁共振方法介绍（三）

自旋捕获电子顺磁共振方法在研究反应活性中间体中已得到广泛应用，并发展为一种可靠的实验方法。对于生物体系中的低浓度、短寿命自由基，自旋捕获技术结合电子顺磁共振技术，在常温下便可对其进行检测。对于不同的自由基，其与捕获剂加合反应后形成的加成物的EPR谱图不同，可以根据EPR谱图结果反推出自由基的种类，对其进行识别。本文以DMPO为例，给大家简单介绍下DMPO捕获自由基的简单谱图分析。

使用DMPO作为自旋捕获剂时，自由基会加成到DMPO中C_α=N上的C_α上，由于电子和核的超精细相互作用，氮和氢核会使EPR谱图由单一的峰裂分为多个峰。对于不同的自由基，形成的自旋捕获加成物中氮核、氢核等磁性核与电子的超精细相互作用不同，会导致EPR谱图不同，因此可根据EPR谱图结果提供所捕获的自由基的信息。

图1 DMPO捕获自由基原理

当我们采集到一张自旋捕获EPR谱图时，可通过四步方法来确定测试的自由基种类。

（1）确定信号出峰范围

对于DMPO捕获自由基形成的加成物，其EPR谱图出峰的范围通常为2A_N+A_Hβ+A_Hγ，一般AHγ≪A_Hβ。以DMPO捕获∙OOH为例，A_N、A_Hβ、A_Hγ如图2所示。根据最低场与最高场超精细分裂峰的间隔，可初步判断自由基种类。如对于饱和烷基，2A_N+A_Hβ约为52 G；不饱和烷基，2A_N+A_Hβ大于56 G；烷氧自由基，2A_N+A_Hβ小于35 G；羟基自由基，2A_N+A_Hβ约为45 G；超氧阴离子、过氧和烷过氧自由基，2A_N+A_Hβ约为38 G。具体数值可参照苏吉虎老师著作《电子顺磁共振波谱：原理和应用》。

图2 DMPO捕获∙OOH的EPR谱图

（2）确定峰的个数与强度

对于不同的自由基，被DMPO捕获后形成的加成物的峰的个数与强度会有所差别。可根据峰的个数与强度进行初步判断。比如DMPO捕获羟基自由基后形成的加成物的EPR谱图有四条峰组成。这主要是因为对于DMPO-*OH，A_N≈A_Hβ，所以四条峰强度比为1：2：2：1，如图3所示。

图3 DMPO-*OH的EPR谱图

（数据由国仪量子EPR系列产品测试所得）

（3）判断A_Hβ大小

对于具有相同信号峰个数的EPR谱图，可根据A_Hβ的大小进行分辨。例如烷氧自由基与超氧阴离子自由基，两者的EPR谱图均为6个峰，谱图较为相似，常会被混淆。

在超氧自由基捕获实验中，通常将烷氧自由基归属于超氧阴离子。那么如何判断捕获到的自由基是烷氧自由基还是超氧阴离子呢？此时可通过EPR谱图A_Hβ的大小来进行判断。

对于烷氧自由基，A_Hβ=7~8 G，对于超氧阴离子，其A_Hβ=9~12 G，如图4所示，且烷氧自由基的超精细分裂峰普通比较宽，且形成重叠，即使降低调制幅度也无法作去卷曲处理。其他类型自由基的超精细分裂峰的峰-谷间隔都比较小，不易发生重叠。

图4 DMPO捕获烷氧自由基与超氧阴离子的EPR谱图对比

（4）加入清除剂进行二次验证

对于羟基自由基、超氧阴离子等可通过加入清除剂，看信号是否减弱进行二次验证。例如，对于羟基自由基，可加入甲醇、乙醇、DMSO等进行二次验证。对于超氧阴离子自由基，可通过加入超氧化物歧化酶（SOD）进行二次验证。

图5 使用乙醇清除∙OH进行二次验证

（数据由国仪量子EPR系列产品测试所得）

为培养国内电子顺磁共振领域的专业后备人才，从2015年至今，中国科学技术大学、中国科学院微观磁共振重点实验室已成功举办了七期电子顺磁共振波谱高级研讨班，加强了学术交流和人才培养，推动了多学科交叉的磁共振波谱学持续发展。

2022年研讨班现场

研讨班由国内电子顺磁共振领域知名专家苏吉虎教授进行授课。针对研讨班不同层次的学员，苏老师从EPR的基本原理出发，结合大量详实的实验范例，进行EPR谱图解析和模拟。同时，学员还可参观并自由使用国仪量子EPR谱仪进行X波段和W波段脉冲EPR的应用，以及DEER、ENDOR等实验，接受苏吉虎老师面对面的指导解谱。

2023年，研讨班将继续在夏天与各位老师同学相约！

国仪量子电子顺磁共振波谱仪搭配原位光照系统、高/低温系统、电化学系统，可用于研究各类顺磁性分子，比如有机自由基、金属配合物、掺杂材料、缺陷材料、金属蛋白等，可满足多场景自由基检测需求。

国仪量子EPR系列

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