干货分享 | CHO 细胞代谢转移的影响、调控及其在流加批次培养工艺中的应用

2023-02-06 10:08:55, Carol Cytiva（思拓凡)

概述

在多种用于异源蛋白表达的系统和培养模式中，治疗性抗体药物的产业化制备始终以哺乳动物细胞大规模培养工艺为主。其中中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是用于治疗性单克隆抗体生产的主要宿主，2016 年至今获批上市的治疗性抗体药物全部为 CHO 细胞来源。但是在目前占主导地位的流加批次培养工艺中 CHO 细胞的新陈代谢远未达到理想和最优状态，其培养工艺的建立需要大量的专业知识以及工艺优化和过程监控。

培养过程中具有毒性和抑制生长的代谢产物的产生和积累，是造成这种情况的主要原因之一。

在这些代谢产物中以乳酸和氨最具代表性，本文将就 CHO 细胞流加批次培养中乳酸代谢的情况进行简单梳理，包括培养过程中乳酸的生成和消耗，乳酸代谢转移发生的机制，影响和调控因素及其在工艺开发中的应用。

流加批次培养中

CHO 细胞的生长及糖代谢特点

体外培养 CHO 细胞的代谢通常以效率低下和次优为特点，特征是高效率吸收培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺等底物作为碳源和氮源。

作为主要碳源的葡萄糖被细胞吸收并磷酸化为 6 磷酸葡萄糖（G6P），用于糖酵解生成三磷酸腺苷（ATP），还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和丙酮酸。丙酮酸可以通过三羧酸循环彻底氧化为二氧化碳和水，释放大量能量供细胞利用；也可以通过乳酸脱氢酶 A（LDHA）的作用与 NADH 的氧化一起转化为乳酸。其中 35％-70％的葡萄糖转变为代谢废物如乳酸，并对细胞培养性能发生不同程度的影响。

CHO 细胞流加批次培养中的生长通常可以分为三个主要阶段，即以细胞密度大幅度增加为主的对数生长期，细胞密度趋于稳定的平台期，以及细胞密度和活率持续下降的凋亡期。

不同生长阶段 CHO 细胞的代谢在很多方面会发生明显变化，在这些代谢变化中乳酸从生成到消耗的转移，是对流加批次培养具有较大影响的是一个关键事件，与批次培养周期的延长、最终产物产量的提高等关系密切。

CHO 细胞流加批次培养中的

乳酸代谢及其代谢转移

乳酸是目前发现的 CHO 细胞培养中主要毒性代谢产物之一，可以引起培养环境的酸性变化，为了维持培养环境的酸碱恒定，需要通过补充碱性物质对 pH 进行调节，而碱剂的补充则会引起渗透压升高，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡从而降低重组治疗产品的生产率，某些情况下也会影响抗体产物的质量。

流加批次培养中乳酸代谢通常会分为两个不同阶段。

对数期

在细胞快速生长的对数期，葡萄糖通过不完全氧化代谢满足细胞快速增殖中对 ATP 和脂肪酸的需求，葡萄糖的快速消耗伴随着乳酸的大量产生。

稳定期

随着细胞由快速生长进入稳定期，乳酸由生成转变为消耗。乳酸从生成到消耗的代谢转变，通常可以作为流加批次培养工艺中细胞代谢效率的标志。

目标蛋白的高表达量与细胞培养中后期乳酸的代谢转移呈强烈的正相关。缺乏有效的代谢转移调控手段，是导致工艺可变性增加的主要因素之一。加强对乳酸代谢的理解对于基于哺乳动物细胞培养的生物工艺具有重要指导意义。当细胞快速增殖被突然打断，糖酵解通量降低，及细胞外乳酸浓度升高等外部条件都可以触发这种代谢转移的发生。

乳酸代谢及其代谢转移的影响及调节因素

流加批次培养中细胞代谢的影响因素及调节策略很多，包括遗传水平的影响及干预，细胞培养基组分的影响及调节，补料策略及培养环境的理化因素等。

遗传水平的干预

从遗传水平对哺乳动物细胞培养中的乳酸代谢进行干预，是指基于细胞培养中的代谢通量研究和转录组学、代谢组学的结果，利用基因工程手段对代谢通路中的关键酶，进行基因水平的调整，制备出代谢特性改善的宿主细胞系。

通过转录组学及代谢通量研究发现，代谢转移时细胞能量代谢相关的酶下调，但是还不足以由此引起代谢转移。细胞外的高乳酸浓度，可以抑制糖酵解途径的关键酶磷酸果糖激酶的活性，降低糖酵解代谢通量，促进乳酸向丙酮酸的转化。在培养的后期，糖酵解活性调节的 AKT1 和 P53 信号通路的转录水平发生变化。

● 以往针对乳酸代谢调整的细胞工程化加工，重点集中在宿主细胞的固有基因的调节。

- 包括降低细胞乳酸脱氢酶的表达水平，促进丙酮酸进入线粒体；

- 通过细胞转运器调节细胞利用葡萄糖或葡萄糖替代物的能力；

- 部分抑制乳酸脱氢酶 A 的基因，降低乳酸的产生以及葡萄糖的消耗，从而改善细胞生长；

- 同时调节乳酸脱氢酶和 3-磷酸甘油脱氢酶活性，改善细胞生长和表达；

- 增加丙酮酸脱氢酶激酶活性减少乳酸积累并增加抗体产量等等。

● 近年来开始尝试在细胞中引入外源基因，对乳酸代谢特性进行调节。

比如重组酵母丙酮酸羧化酶（Recombinant yeast pyruvate carboxylase PYC2）。

研究发现，稳定表达外源 PYC2 的 CHO 细胞来源的单抗表达克隆，在培养中倾向于向乳酸消耗的显著和系统性代谢转变，可有效延长细胞培养的对数生长期，提高细胞峰密度，进而增加抗体产物的表达量，见图 1。

即使在高葡萄糖水平下，表达 PYC2 的 CHO 细胞克隆，在流加批次培养中也能保持高效的代谢特性，从而降低了在细胞培养工艺中为了避免乳酸堆积，而不得不将葡萄糖浓度控制在较低水平的必要，而因此减轻了培养中维持低水平葡萄糖对抗体产品糖基化的潜在负面影响。

在 DG44 细胞中引入丙酮酸羧化酶（hPC）基因，也可以导致乳酸生成的减少。此外，抗细胞凋亡基因可显著改变 CHO 细胞的乳酸代谢，诱导向乳酸消耗的代谢转变，并使最终抗体产量提高。

图1. 外源酵母丙酮酸羧化酶 2（PYC2）阳性克隆乳酸代谢改善明显

细胞培养基成分及补料策略

用于 CHO 细胞培养的无血清培养基通常富含葡萄糖和谷氨酰胺，是支持细胞快速生长所必需的，与永生化细胞中底物的部分氧化的代谢特性相关。即使有足够的氧气供应，葡萄糖依然通过部分氧化转化为乳酸，而不是完全氧化为 CO₂ 和 H₂O。

因此可以通过使用代谢相对缓慢的碳源替代培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺，比如利用果糖、麦芽糖和半乳糖替代葡萄糖，谷氨酸替代谷氨酰胺来减缓乳酸的积累。

对于乳酸堆积倾向较严重的细胞克隆，也可以通过控制培养体系中的葡萄糖浓度，比如将葡萄糖水平控制在<0.2 mM；或按照培养环境 pH 监测反馈，进行补糖等方法来避免或减轻乳酸堆积。

另外在培养基添加硫酸铜也可以有效缓解乳酸堆积，尤其在葡萄糖过量的情况下。

在培养过程中适时、适当和安全的营养补充策略的建立非常重要。

不同的细胞类型甚至相同来源的细胞克隆，都可能有各自不同的代谢特点及合适的补料策略。从乳酸代谢的角度，补料策略可以着眼于代谢限制，比如限制碳源的补充；可以通过实时或在线监测细胞代谢及营养物质消耗情况指导补料策略。比如图 2 和图 3 所示的案例中，以 ActiPro 作为基础培养基，由于该克隆抗体特性表达率（Qp）较低，较低的 Cellboost7a/7b 补料量在细胞代谢和细胞生长，产物表达等表现更好。

图2. ActiPro 作为基础培养基，不同 Cellboost7a/7b 补料策略的细胞生长及抗体表达情况

图3. ActiPro 作为基础培养基, d3 开始每天分别补充 Cellboost7a/7b 2%/0.2% 的细胞代谢情况

培养温度控制策略

培养温度是细胞培养最重要的工艺参数之一，与其他工艺参数（例如 pH 值，溶氧和二氧化碳分压）相比，培养温度更易于控制。工业生产中 CHO 细胞的流加批次培养工艺，很多时候会采用降温控制策略（Temperature shift ，TS)。

-- 降温控制策略 TS

在批次培养的对数生长期采用 37°C 左右的生理温度使细胞快速生长，尽快达到足够细胞密度以生产抗体等产物。而在细胞进入对数后期及产物蛋白表达的平台期，通过较低的次优培养温度，使细胞停滞于 G1 期降低细胞凋亡率，来延长细胞维持较高活细胞密度的培养时间，以获得更多的产物蛋白。

乳酸代谢对培养温度也很敏感，通常认为细胞培养过程中改变培养温度，可能是乳酸由生成向消耗转移的触发因素之一。

但是在实际工艺开发中，会发现随着低温相所采用培养温度的升高，会加速乳酸的消耗。比如在降温后温度高于 34°C 的条件下，乳酸代谢转移发生较早，而且乳酸峰值较低，而当温度降低至低于 33°C 时，则乳酸峰值浓度更高，代谢转移发生较晚。因此在采用降温处理时应兼顾乳酸代谢情况。

此外需要注意的是，CHO 细胞培养中的降温策略对关键质量属性（聚集体，电荷异构体，N-糖基化和宿主细胞残留蛋白）的影响，进行降温控制时必须同时考虑产物表达和产物质量属性。这种温度控制策略对细胞的生长、代谢，产物表达及产品质量的影响具有细胞系特异性。

因而在实际工艺开发中需要针对不同细胞克隆对降温策略进行优化，包括降温开始时间，降温度幅度，采用逐步降温还是一步到位降温方法等。

培养环境的 pH

理想中的 pH 值应在整个培养过程中保持恒定，不需要通过酸性或碱性试剂进行调节。

但实际情况不可能如此，在流加批次培养过程中乳酸的产生会导致 pH 下降，过低的 pH 抑制细胞的增殖，需要通过添加碱剂进行调节。

渗透压增加通常是 pH 控制策略欠佳的结果。

依据克隆和细胞类型的不同，哺乳动物细胞培养中的最低 pH 极限通常在 6.6–6. 8 之间。许多生物工艺都始于高 pH 值，培养过程中逐步降低。但是培养过程中 pH 值降低的速度往往不足以阻止乳酸的积累。

在适合细胞生长的范围内，偏高的培养环境 pH 通常与更快细胞的代谢速率相关，因此在细胞培养工艺开发中，有时会通过在较低 pH 下操作，以抑制细胞增殖为代价来限制乳酸的产生。

而且 pH 值有时会与抗体产品的质量相关，此时需要同时兼顾乳酸代谢和产品质量。因此迄今为止，对于流加批次培养工艺中的 pH 控制方式仍然没有固定的策略。

图4. 流加批次培养中环境 pH 对乳酸代谢的影响情况

CO₂ 分压

与小规模培养相比，乳酸的产生通常会随着培养规模的扩大而增加，大规模培养时乳酸消耗的代谢转变减少或完全不发生。引起这种现象的原因可能与不同规模生物反应器的气体交换特点相关，比如小体积反应器的 CO₂ 排出效率远远高于大体积反应器，目前已发现培养工艺中的 pCO₂ 可能会影响乳酸的产生。

有研究发现，在流加批次培养过程中 pCO₂ 控制在 12.5％时，乳酸可以在培养中由生成转变为消耗；而当 pCO₂ 升高为 20％时，整个流加批次培养过程中都有乳酸生成。

进一步研究发现，代谢转移发生前后 CO₂ 分压对细胞代谢的影响是不同的。代谢转移发生前，pCO₂ 升高时细胞的单位氧消耗率下降，表明此条件下细胞的氧化能力较弱，因此引起乳酸持续生成。而代谢转移发生后，不同 pCO₂ 条件下细胞的平均耗氧量和细胞生长的平均速率相似。但是较低 pCO₂ 条件下，葡萄糖消耗量更低，细胞更倾向于消耗乳酸和氨。

目前认为乳酸代谢转移前细胞的代谢差异，是引起流加批次培养过程中乳酸代谢差异的主要原因，而代谢转移发生后的细胞代谢差异在某种程度上可能是乳酸代谢差异的结果。不同 pCO₂ 条件下，pH 值曲线差异轻微但渗透压浓度却可能差异巨大。较高 pCO₂ 条件下的渗透压往往更高，进一步影响细胞代谢。

对于 pCO₂ 对细胞乳酸代谢影响的机制还无法确切解释，目前认为可能与 CO₂/HCO₃^-参与酶促反应调节相关。在流加批次培养中通过降低的 CO₂/HCO₃^- 浓度，可促进乳酸向消耗代谢方向转变，对于缓解或解决大规模流加批次培养或灌流培养时的乳酸堆积具有重要意义。

图5. 流加批次培养中不同 pCO₂ 条件下的乳酸代谢情况

图6. 流加批次培养中不同 pCO₂ 条件下的渗透压变化情况

本文简要介绍了CHO细胞作为宿主表达重组蛋白和单抗的流加批次培养中乳酸代谢，及其代谢转移的影响及控制因素，以期在流加批次培养工艺的建立中提供细胞代谢层面的理论依据。

敬请期待后续实践篇：“单克隆抗体 (mAb) 生产CHO细胞系的分批补料培养工艺建立及优化”。

参考文献：（上下滑动查看完整）

1.Effects of feeding strategy on CHO cell performance in fed-batch cultures using HyClone™ ActiPro™ medium and Cell Boost™ 7a and 7b supplements

2.Improving Lactate Metabolism in an Intensified CHO Culture Process: Productivity and Product Quality Considerations

3.High-end pH-controlled delivery of glucose effectively suppresses lactate accumulation in CHO fed-batch cultures.

4.Consequences of trace metal variability and supplementation on Chinese hamster ovary (CHO) cell culture performance: A review of key mechanisms and considerations.

5.Benchmarking of commercially available CHO cell culture media for antibody production

6.On metabolic shift to lactate consumption in fed-batch culture of mammalian cells

7.Elevated pCO2 affects the lactate metabolic shift in CHO cell culture processes

8.Metabolic engineering of CHO cells to alter lactate metabolism during fed-batch cultures

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