2022-12-20 05:07:16, 阿迪 上海吉凯基因医学科技股份有限公司
近年来外泌体的研究热度持续攀升,吉凯基因已经助力老师们在肿瘤领域发表了多篇文献[1,2]。那么外泌体是什么,又是如何助力老师们实验的升华呢?外泌体是从活细胞释放到细胞外微环境的50-150nm大小的囊泡,由于肿瘤来源的外泌体调节肿瘤的微环境并协助远处转移,所以,外泌体可以作为递送基因的载体,通过瘤内注射或静脉注射,起到抗肿瘤的效果。
同样做递送基因的载体,工具病毒也在抗肿瘤的“江湖中”占有一席之地。慢病毒转导的T细胞进行体外基因治疗[3],在治疗肿瘤方面具有显著疗效,但价格昂贵,且技术上也有挑战性;而腺相关病毒(AAV)已被临床实验(遗传性失明、脊髓性肌萎缩)证明,在体内实验安全有效,那么AAV如何提高转染免疫细胞的效率呢?我选择了一篇技术干货,帮助老师们理解。
作者将广谱启动子CBA和报告基因(GFP)构建到scAAV中,经过流式分析验证:scAAV感染体内的免疫细胞是可行的。此外,为了观察scAAV携带的基因在体内表达的动力学,作者将9E+11vg的exo-scAAV8,尾静脉注入小鼠体内,并在注射后的3天、7天、14天、21天、28天从小鼠血液中提取免疫细胞进行分析,结果显示:CD4+T细胞、CD8+T细胞在AAV注射后14天达到峰值;B细胞在注射后3天达到峰值,且两周内保持相对稳定[4]。文章中使用的scAAV是指经过ITR改造,自互补AAV(scAAV,即双链AAV)绕过了第二链合成的限速步骤,除了提升载体递送效率之外,还可增加体内外转基因表达的强度、缩短开始表达时间,以及具有更高的体内DNA稳定性和更有效的环化作用,低剂量scAAV即可实现高剂量ssAAV的表达效果,可以有效降低动物实验的成本,尤其是以猪、猴子等大型动物为研究对象的实验。
CD25分子是IL-2R的α链,也是调节性T(Treg)细胞表面特征性标记分子。为了测试AAV介导的体内转染,在小鼠免疫细胞表面表达人受体的可行性。作者构建exo-AAV,采用三质粒系统:exo-AAV质粒、rep/cap质粒(AAV8型)和辅助质粒(pAdΔF6),exo-AAV载体通过差速离心分离,用连续2轮超离心在氯化铯密度梯度下从细胞裂解液中纯化[5]。成品经过qPCR检测滴度后,应用到动物实验。结果显示:在肝脏中,24.4%的CD4+T细胞,12.9%的CD8+T细胞,39.7%的B细胞表达hCD25。
在本文中,作者为了增加AAV在体内的转染效率,构建了exo-scAAV8-CBA-hCD25-GFP的载体。不仅降低了注射AAV的剂量,而且exo-scAAV8的衣壳还可以保护工具病毒,免受宿主抗体的攻击(体内存在scAAV8抗体的患者,可以选择exo-AAV8);外泌体偶联AAV后,使工具病毒感染细胞的能力进一步提高。在抗肿瘤治疗中,慢病毒凭借着容量大(能携带6k的目的基因),能整合到宿主染色体中,介导细胞的稳定转导,成为体外基因治疗的首选;而AAV经过科学家的改造,未来可能成为体内基因治疗的首选。
结 语
套用一句带货主播的经典语录,把AAV基因治疗的价格打下来。通过两个方面:一是改造血清型,使AAV结合特定细胞的亲和力变强;二是构建特异性启动子,增加AAV靶向特定细胞的精准性,亲和力和精准性。AAV靶向组织的亲和力和精准性提高了,所需AAV的剂量自然就小了,成本就降下来了。
【参考文献】
1. Shen DD, Pang JR, Bi YP, Zhao LF, Li YR, Zhao LJ, Gao Y, Wang B, Wang N, Wei L, Guo H, Liu HM, Zheng YC. LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer. Mol Cancer. 2022 Mar 16;21(1):75. doi: 10.1186/s12943-022-01557-1. PMID: 35296335; PMCID: PMC8925194.
2. Huang K, Fang C, Yi K, Liu X, Qi H, Tan Y, Zhou J, Li Y, Liu M, Zhang Y, Yang J, Zhang J, Li M, Kang C. The role of PTRF/Cavin1 as a biomarker in both glioma and serum exosomes. Theranostics. 2018 Feb 7;8(6):1540-1557. doi: 10.7150/thno.22952. PMID: 29556340; PMCID: PMC5858166.
3. Yu J, Wu X, Yan J, Yu H, Xu L, Chi Z, Sheng X, Si L, Cui C, Dai J, Ma M, Xu T, Kong Y, Guo J. Anti-GD2/4-1BB chimeric antigen receptor T cell therapy for the treatment of Chinese melanoma patients. J Hematol Oncol. 2018 Jan 3;11(1):1. doi: 10.1186/s13045-017-0548-2. PMID: 29298689; PMCID: PMC5751546.
4. Breuer CB, Hanlon KS, Natasan JS, Volak A, Meliani A, Mingozzi F, Kleinstiver BP, Moon JJ, Maguire CA. In vivo engineering of lymphocytes after systemic exosome-associated AAV delivery. Sci Rep. 2020 Mar 11;10(1):4544. doi: 10.1038/s41598-020-61518-w. PMID: 32161326; PMCID: PMC7066196.
5. Meliani A, Boisgerault F, Fitzpatrick Z, Marmier S, Leborgne C, Collaud F, Simon Sola M, Charles S, Ronzitti G, Vignaud A, van Wittenberghe L, Marolleau B, Jouen F, Tan S, Boyer O, Christophe O, Brisson AR, Maguire CA, Mingozzi F. Enhanced liver gene transfer and evasion of preexisting humoral immunity with exosome-enveloped AAV vectors. Blood Adv. 2017 Oct 16;1(23):2019-2031. doi: 10.1182/bloodadvances.2017010181. PMID: 29296848; PMCID: PMC5728288.
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
6.单细胞测序
8.悬浮细胞专用病毒
10.测序技术研究与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章
20.吉凯病毒神经方向应用案例
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