应用速递：亚硝胺杂质的测定

2022-12-08 10:36:31 默克生命科学

缬沙坦是血管紧张素II受体阻滞剂（ARB）、联苯四氮唑结构的沙坦类化合物，用于各类轻中度高血压的治疗，尤其适用于ACE抑制剂不耐受的患者。2018年7月，药品监管部门首次在含有缬沙坦的产品中发现亚硝胺杂质——N二甲基亚硝胺（NDMA）。随后在沙坦类其他药物和雷尼替丁中都检测到各类亚硝胺杂质，例如N-二乙基亚硝胺（NDEA）、N-二异丙基亚硝胺（NDIPA）、N-乙基异丙基亚硝胺（NEIPA）和N-亚硝基二丁胺 (NDBA)。因此，对使用缬沙坦原料药的药品进行了全球召回，导致缬沙坦药品暂时短缺。

图1 N-亚硝胺的分子结构

根据世界卫生组织 (WHO) 的国际癌症研究机构 (IARC)的研究，大多数亚硝胺会对动物和人类具有致癌和遗传毒性。沙坦类药物大多含有四唑环，四唑环的形成需要亚硝酸钠；药物的生产设备、生产用试剂和溶剂（例如普通溶剂DMF中的二甲胺）也可能会带来污染，都有可能形成亚硝胺。欧洲药典 (Ph. Eur.) 委员会将 API 中亚硝胺的临时限值设定为低于 1 ppm，且于2020年底降至30 ppb。

低限值设定就需要使用灵敏度高和选择性好的分析方法。本应用参照美国FDA指南的方法进行优化，通过GC/MS/MS在EI源 MRM模式下痕量检测缬沙坦药品中的5种亚硝胺杂质 (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA)，并根据USP要求进行方法学验证。

货号	产品名称
24284	SUPELCOWAX^® 10 气相毛细管柱30 m × 0.25 mm，0.50 μm
1.00668	SupraSolv^® GC-MS二氯甲烷
CRM40059	N-亚硝基二甲胺(NDMA)，5000 μg/mL溶于甲醇
PHR2407-100MG	N-亚硝基二甲胺
40334	N-亚硝基二乙胺(NDEA)，5000 μg/mL溶于甲醇
PHR2408-1G	N-亚硝基二乙胺
PHR3609-1ML	N-亚硝基异丙基乙胺(NEIPA / NIPEA)
PHR3607-1ML	N-亚硝基二异丙基胺(NDIPA)
48320-U	N-亚硝基二正丁胺，2000 μg/mL溶于二氯甲烷
PHR3608-1ML	N-亚硝基二正丁胺 (NDBA)
PHR3610-1ML	N-亚硝基甲基氨基丁酸 (NMBA)
PHR3611-1ML	N-亚硝基甲基苯胺 (NMPA)
502138	EPA 8270/附录 IX 亚硝胺混标 (9种组分：N-亚硝基二正丁胺 (NDBA)，N-亚硝基二乙胺，N-亚硝基二甲胺，N-亚硝基二苯胺，N-亚硝基二丙胺，N-亚硝基甲乙胺，亚硝基吗啉，1-亚硝基哌啶，1-亚硝基吡咯烷)
40035-U	EPA 521 亚硝胺混标 (7种组分：N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基甲乙胺、N-亚硝基二乙胺、1-亚硝基吡咯烷、1-亚硝基哌啶)

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GC-MS/MS 方法检测不同的亚硝胺化合物，使用液体直接进样方式。与FDA方法相比，选择了膜厚更薄（0.5µm而不是1µm）的Supelcowax®柱，符合USP通则中<621>色谱法的规定。色谱条件以及质谱条件见表1-3。

表1 色谱条件

色谱柱	SUPELCOWAX^® 10, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.5µm (24284)
检测器	MS/MS
进样口温度	250℃
柱温箱程序	40℃保持0.5min，20℃/min至200℃, 60℃/min 至250℃保持3min
载气及流速	氦气，1.0mL/min
衬管	4 mm单径锥衬管带玻璃棉
进样量	2 µL
样品稀释剂	二氯甲烷
样品制备	使用切片工具，取药片的四分之一放入15mL离心管，加入5mL二氯甲烷。将样品涡旋1分钟，并置于离心机中以4000 rpm离心2.5min。取二氯甲烷层上清液2mL，用0.45µm PVDF膜过滤。取续滤液0.5mL到2mL样品小瓶中并加盖。
标准溶液	二氯甲烷作为溶剂，配制得到浓度分别2.5、5.0、10、20、40、80、100ng/mL的5种亚硝(NDMA/NDEA/NEIPA/NDIPA/NDBA)校准溶液。

表2 质谱条件

调谐	自动调谐
离子源及采集模式	EI源，MRM
碰撞气体	氮气 @ 1.5mL/min
淬灭气体	氦气 @ 4.0mL/min
溶剂延迟	7 min
离子源温度	230°C
四极杆温度	150°C
电离电压	70 eV
驻留时间	50 ms

表3 MRM 离子对参数列表

峰	化合物	Transiton	保留时间
1	N二甲基亚硝胺MRM2	74→42	6.952
1	N二甲基亚硝胺MRM1	74→44	6.952
2	N-二乙基亚硝胺MRM 1	102→85	7.533
2	N-二乙基亚硝胺MRM2	102→56	7.528
3	N-乙基异丙基亚硝胺MRM1	116→99	7.784
3	N-乙基异丙基亚硝胺MRM2	71→56	7.787
4	N-二异丙基亚硝胺MRM1	130→42	7.971
4	N-二异丙基亚硝胺MRM2	130→88	7.976
5	N-亚硝基二丁胺MRM1	158→99	9.497
5	N-亚硝基二丁胺MRM2	84→56	9.494

五种亚硝胺化合物在10分钟内完全分离，且目标峰与溶剂和基质杂质得到了很好的分离（图 2）。由于使用了0.5µm膜厚的色谱柱，与 FDA 方法相比，分离时间更短。

图2 40 ng/mL系统适用性溶液色谱图，峰表见表3.

实验得出：N-二乙基亚硝胺(NDEA)和N-二异丙基亚硝胺(NDIPA)的多反应监测MRM Transition最低检测限浓度为2.5ppb，如图3所示。

图3 NDEA（上图）和 NDIPA（下图）最低检测限谱图

经验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 标准品六次重复进样的 RSD%≤ 5%。使用我们的方法，连续6次进样 40 ng/mL 的5种亚硝胺杂质，在两种 MRM 下的 RSD%远小于 5，如表4所示。

化合物	MRM1 RSD%	MRM2 RSD%
N二甲基亚硝胺	1.8	1.3
N-二乙基亚硝胺	1.1	1.1
N-乙基异丙基亚硝胺	4.2	1.5
N-二异丙基亚硝胺	0.9	2.2
N-亚硝基二丁胺	4.3	3.0

表4 40ng/mL 亚硝胺标准品连续六次进样的精密度

此外，线性校准曲线的相关系数R2应≥ 0.998。本方法中五种亚硝胺杂质的两个 MRM都超过了这一标准（表 5）。

杂质	MRM 1	MRM 2
N二甲基亚硝胺	0.9994	0.9995
N-二乙基亚硝胺	0.9991	0.9995
N-乙基异丙基亚硝胺	0.9995	0.9995
N-二异丙基亚硝胺	0.9996	0.9994
N-亚硝基二丁胺	0.9983	0.9981

表5 两种MRM定量中两种亚硝胺的相关系数 (R2)

在药店购买的缬沙坦药品中加入亚硝胺杂质，浓度为10 ppb（NDBA为40 ppb），5种亚硝胺的回收率在94.5%～105.7%之间。（表6）。

杂质	10ppb回收率
NDMA	99 %
NDEA	99 %
NEIPA	94.5 %
NDIPA	103.9 %
NDBA	105.7 %

表6 缬沙坦药品中5种亚硝胺的加标回收率

对于缬沙坦药品中5种亚硝胺的检测，FDA 方法的定量限 (LOQ) 范围是 8 – 40 ppb，本实验方法的 LOQ见表 7。LOQ 是根据每种化合物校准曲线信噪比 (S/N) 为 10 浓度计算得出的，并且通过缬沙坦片剂的标准添加实验进行了验证。检出限LOD是信噪比 (S/N) 为 3 的浓度计算得到。