探秘肿瘤微环境,原位“看透”细胞因子

2022-12-06 15:39:00, 安捷伦科技 安捷伦细胞分析事业部(BioTek)


细胞因子是肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)中细胞通讯的关键介质,在癌症的发生、发展、治疗和预后等多个方面发挥重要作用。在过去的 40 年中,细胞因子和细胞因子受体作为癌症靶点或癌症治疗方法得到了广泛的研究。目前公认的临床前治疗策略为增强干扰素和白细胞介素(包括 IL-2 ,IL-7 ,IL-12 和 IL-15 )的生长抑制和免疫刺激作用,或抑制细胞因子(如 TNF ,IL-1β 和 IL-6 )的炎症和促进肿瘤的作用[1]


图 1 . 细胞因子在肿瘤微环境中的作用


特定细胞因子的表达也与肿瘤细胞的高存活率和高转移性密切相关。其中促炎细胞因子 IL-6 和 IL-8 与多种癌症相关,包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌等 [2,3]。因此,分析细胞因子的表达是一种重要的诊断工具和预测癌症预后的关键因素。


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非放射性的 RNA 原位杂交技术(ViewRNA ISH)是一种高灵敏度的检测细胞因子表达的有效方法,并且可以对 1 至 4 个 mRNA 目标进行多重分析。

检测原理如下图所示:

图 2 .  ViewRNA ISH 检测原理


安捷伦BioTek Cytation 5 多功能细胞成像微孔板检测系统,可容纳多达四个荧光通道同时成像,快速并出色地成多色荧光成像。仪器配备的高内涵分析软件可自动计算细胞内 RNA 的表达水平。Cytation 5 活细胞成像工作站结合ViewRNA ISH为细胞因子研究提供了一种高效率、高灵敏度和可重复的检测方法。

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实验案例分享


 实验一.细胞因子mRNA的成像和分析 

为研究细胞因子mRNA 在不同营养条件下的表达情况,设置两组对照实验。阳性对照细胞培养于完全培养基中,而阴性对照细胞经过 18 小时的血清饥饿处理。随后加入 ViewRNA 探针以标记 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ,在Cytation 5 上分别使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道对探针进行成像完成 ISH 细胞分析。图像结果表明:细胞因子mRNA 的表达在营养匮乏的条件下会显著降低。


图 3 . 阳性和阴性对照组成像。HCT116 放大 20 倍图像作为( A )阳性对照和( B )阴性对照。MDA-MB-231 细胞放大 40 倍的图像作为( C )阳性对照和( D )阴性对照。蓝色:DAPI 染色的细胞核;绿色:标记 IL-8 mRNA ;橙色:标记 IL-6 mRNA ;红色:标记 ACTB mRNA 。


接下来为了定量分析细胞因子表达,首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下进行细胞核计数,以确定每孔的细胞数量(图 4A )。然后分别在GFP 、RFP 通道进行细胞因子探针( IL-6 或 IL-8 )的荧光信号分析(图 4B )。通过细胞荧光信号的比率评估不同实验条件下的细胞因子表达(图 5 )。


图 4 . 每个细胞的荧光信号分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 软件进行细胞分析圈选出 DAPI 标记的细胞核;( B ) 荧光标记的 IL-8 信号的图像分析。



如图 5 所示,使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合准确的量化了细胞内 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。


图 5 . MDA-MB-231 细胞中 IL-8 表达和 HCT116 细胞中 IL-6 表达,并以细胞数目进行校正。


 实验二.诱导细胞因子 mRNA 的表达 

使用不同剂量的 IL-1β 刺激 DU145 细胞,以分析细胞因子的 mRNA 的表达(图6)。图 7 结果显示:虽然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表达增加,但 IL-8 的表达变化更为显著,这与先前研究结果一致[4]。IL-1β 的最高剂量下,这两种细胞因子的表达减少则是由于细胞毒性。这验证了该检测方法的可行性与稳定性。


图 6 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号 ( A ) 0 ng/mL;( B ) 0.02 ng/mL ;0.128 ng/mL;( D ) 0.8 ng/mL。蓝色:DAPI染色的细胞核;绿色:标记的IL-8 mRNA;橙色:标记的 IL-6 mRNA ;红色:标记的 ACTB mRNA 。


图 7 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下 DU145 细胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。


 实验三.抑制细胞因子 mRNA 的表达 

研究表明丝裂原活化蛋白激酶( MAPK )可调节 IL-8 ,并证明用 MAPK/ERK 抑制剂 U 0126 治疗可减少 DU145 和 MDA-MB-231 细胞中的炎症细胞因子[4,5]。为了确认这一现象并验证 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合的能力,将不同浓度的 U 0126 加入到每种细胞类型中孵育 30 分钟。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 细胞达 3 小时,而 MDA-MB-231 细胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道进行细胞计数和图像分析以评估在 U 0126 治疗后 IL-8 和 IL-6 细胞因子 mRNA 的表达。采集的图像(图 8 )和计算的荧光信号强度 (图 9 )证实了 U 0126 的抑制作用。此外,也验证了该方法的灵敏度,可以准确识别给予抑制剂后 mRNA 的表达变化。


图 8. U 0126 抑制 IL-8 mRNA 的表达。图像显示了在不同浓度的 U 0126 处理后 ( A-E ) MDA-MB-231 细胞内 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号;( F-J ) 为 DU145 细胞。蓝色:DAPI 染色的细胞核;绿色:标记的 IL-8 mRNA ;橙色:标记的 IL-6 mRNA ;红色:标记的 ACTB mRNA 。


图 9 . U 0126 治疗后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 细胞中的表达


结 语



ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 细胞分析试剂盒和探针提供一种灵敏的方法来检测 mRNA 表达。该方法在安捷伦BioTek Cytation 5 细胞成像系统的加持下得以更更快地采集多荧光通道的图像,并更精准的计算出每一个细胞的荧光信号强度。这种检测、成像和分析的完美结合提供了一种灵敏、灵活和高通量的方法用以检测细胞因子 mRNA 的表达。


参考文献:

[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.

[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.

[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.

[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.

[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18. 



关于 BioTek

BioTek 是世界领先的多功能微孔板检测仪及软件的研发生产公司,拥有 54 年的悠久历史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪拥有灵活的功能配置和优异的检测结果,配合友好强大的操作软件,为广大用户提供了便捷高效的使用体验。服务科学,促进科学始终是我们追求的目标。2019 年 BioTek 加入安捷伦科技有限公司,成为细胞分析事业部的重要组成成员。


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