2022-12-06 04:02:18, 杨向妮 Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs)
引 言
现代合成化学家正在以更高的通量合成越来约具有挑战性的结构高度相关的多组分混合物。为了分离这些具有非常相似的物理性质的混合物,需要花费大量的人力物力进行方法开发。在许多情况下,单纯依靠科学家的经验知识优化分离度是及其困难的。而计算机辅助色谱建模策略正在迅速成为药物研发的有力帮手。它们有助于简化分析方法耐用性研究,使分析方法有效地转移到生产上。
本文描述了一种使用多柱和多溶剂切换的 UHPLC结合色谱模拟软件 (ACD Labs/LC Simulator) 进行方法开的工作流,该方法广泛应用于结构高度相似的中间体和杂质的多组分反应物的分离和分析。通过实验数据证明了该方法可以分离分析新药物合成中使用的催化剂在工艺优化过程中形成的杂质。
实验部分
案例介绍
文献中以图1所示的二聚体催化剂及生产过程中形成的杂质为例介绍了分析方法开发的过程。该二聚体催化剂广泛应用于各种活性药物成分(APIs)的研发。
图1二聚催化剂及有关杂质结构
筛选平台搭建
文献中共筛选了7种弱洗脱流动相,2种强洗脱和6根色谱柱:
(1)弱洗脱流动相的组合见如图2,A1-A7;
(2)强洗脱种类甲醇和乙腈;
(3)色谱柱包括Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, SB-CN, SB-C8, and SB-Phenyl(50*21.mm, 1.8μm),Hypersil Gold AQ and Gold PFP(50*21.mm, 1.9μm)。
图2多柱筛选UHPLC仪器配置
色谱条件:
梯度程序:
柱温:40 °C, 检测波长:210nm, 流速:0.6 mL/min,进样量及样品:2 μL ,约0.25 mg/mL 反应液混合物(稀释剂:H2O:CH3CN (50 : 50, v/v))。
筛选结果
图3a展示了在酸,中及碱性pH条件下Eclipse C18色谱柱上的筛选结果。其中35 mM KPF6的0.1% H3PO4 水溶液是唯一能够分离这些反应液中的大多数组分条件。
图3a在Eclipse色谱柱上不同添加剂的筛选结果
PF6-是一种离液性(亲脂性)反离子(Hofmeister系列中最强),主要通过破坏电离碱性分析物的溶剂化壳来促进保留,并在保留过程中引入弱离子对组分。另一种保留机制可能包括吸附在吸附剂表面上的离液(亲脂性)离子,在表面产生电荷,并在被吸附离子和带电分析物之间产生相应的静电相互作用。
有趣的是,基于 0.1% H3PO4(水溶液)的洗脱液本身并不能基线分离所有反应物,另一种非常有效的离液剂洗脱液(150 mM NaClO4·H2O 溶于 0.02% HClO4)也不能分离所有的混合物。从图3b中可以看出,KPF6 添加剂在使用 C18、C8 和 CN 色谱柱时产生了出色的色谱性能和分离度,但在使用 Phenyl、PFP 和 AQ 色谱柱时结构却令人失望。
图3b 6根色谱柱在35 mM KPF6的0.1% H3PO4体系下的筛选结果
KPF6添加剂在使用C18、C8或CN固定相时产生了优异的色谱性能和分离度,而在使用苯基、PFP和AQ柱时则失效。所有这些都表明,π -π相互作用不是这种分离机制的驱动因素;相反,疏水性结合PF6-反离子的离液性效应增强了反应液中碱性分析物的选择性和保留性。
KPF6添加剂溶度研究
KPF6添加剂为非常规添加剂,并且市售的纯度为99.5%。为了解缓冲液浓度对和基线信号的影响以及添加剂中含有杂质对目标峰潜在干扰的问题,对KPF6添加剂的浓度进行了详细研究。
图4a 不同KPF6浓度下的整体色谱图及咪唑醇的保留时间的影响
35 mM KPF6可提供所有组分的最佳峰形、保留和分离,基线信号中没有任何峰干扰。此外,将 KPF6 的浓度增加到 35 mM 有助于使咪唑醇的保留。
图4b 35mM KPF6浓度下基线
计算机模拟
LC-Simulator的实验条件
在回顾和评估上述筛选结果后,选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm × 50 mm,1.7 μm)继续开发UHPLC方法分离多组分反应混合物,需要指出的是根据施耐德疏水减法模型BEH C18和Eclipse C18具有非常相似的选择性。BEH C18 固定相使用Waters专有的桥接乙烯杂化二氧化硅载体封端,表面积为 180 m2/g,孔径为 130 Å,可在高 pH 范围 (pH 1-12) 下运行。
流动相A:35 mM KPF6的0.1% H3PO4的水溶液
流动相B:乙腈
作者接着在构建了梯度 & 温度2D分离度模型,其中温度设计为20℃和40℃,有效梯度洗脱程序为5-95% B在5.5 min和5-95% B在15.5 min,构建的分离度图见图5a。通过2D分离度图可以快速确定有效分离所有组分的最佳条件,特别是所非常难以分离的关键对(化合物 5、6 和 7)。并且还可以从分离度图中选择更稳健的方法(以橙色显示)。
模拟结果
图5 (a)构建的2D分离度图;(b)从分离度图中找到的梯度 & 温度组合条件的预测谱图;(c)不同样品走的试剂谱图
图5b显示了来自分离度图耐用区域的模拟色谱图。图5c中的实验数据包括两种分析物标准混合物(标准混合物1和2)的分离以及干燥的固体催化剂。预测数据(图5b)和实验数据(图5c)之间的匹配非常好,预测数据和实验数据之间的总体ΔtR差异低于3.7%(表1)。
最终色谱条件
样品浓度:约0.25 mg/mL;进样量:2 μL;柱温:30°C;洗脱液A:35 mM KPF6的 0.1% H3PO4 (aq.),洗脱液B:CH3CN;梯度:0分钟(5% B), 7分钟(50% B), 10分钟(95% B), 10.1-13 (5% B);流速:0.6 mL/min;紫外检测:210nm。
该方法已被有效地用于支持二聚体催化剂的工艺优化,指导制药化学家的工艺优化工作。所有这些结果都说明了现代色谱模拟和建模软件在方法耐用性的开发和优化方面的力量。
讨 论
毫无疑问,现代色谱分离技术,包括多柱筛选和色谱建模,将是学术界和工业界合成化学家工具箱中的一个伟大的补充。重要的是要认识到,这些工具的价值不仅在于减少寻找适当的固定相和流动相所需的时间,以及开发可靠的色谱方法,而且在于允许快速和方便地解决在合成化学研究中可能得不到解答的问题。
作者们说明了使用其非手性UHPLC多柱和多溶剂筛选结合色谱模拟和建模软件(ACD/ Labs/LC-Simulator)在分离和分析结构密切相关的合成中间体和杂质的多组分反应混合物的方法开发中的好处。
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