BD Rhapsody单细胞多组学联合流式助力中性粒细胞谱系发育研究

2022-12-01 09:59:00, 小海胆上海吉凯基因医学科技股份有限公司

推文前言

众所周知，粒细胞是一群非常脆弱的细胞，也是目前很多单细胞RNA测序平台很容易丢失的一类细胞。BD Rhapsody单细胞多组学技术，基于微孔和自然沉降原理对单细胞进行分离捕获，无额外压力刺激，对细胞更温和，可实现高通量和高效率捕获。

今天分享的文章是近期发表在Nature Immunology（IF=20.5）期刊的“CD66b⁻CD64^dimCD115⁻ cells in the human bone marrow represent neutrophil-committed progenitors”，作者通过联合BD流式和单细胞多组学技术对骨髓CD66b⁻CD64^dimCD115⁻的中性粒定向祖细胞（neutrophil-committed progenitor cells，NCPs）进行了系统性研究，结果发现NCPs存在4种处于不同成熟阶段的细胞亚群，且可通过2条不同的分化途径定向分化为CD66b⁺的中性粒细胞。最后通过比较转录组和表型特征发现，NCPs较之前报道的“早期中性粒前体细胞”更为幼稚。

技术亮点

BD Rhapsody单细胞多组学与流式技术：

BD Rhapsody单细胞多组学分析系统

BD Rhapsody人样本标签试剂盒

BD Rhapsody 全转录组扩增试剂盒

BD 流式分析仪LSRFortessa X-20

BD 流式分选仪 FACSAria Fusion

流式数据分析软件 BD FlowJo v10

研究背景

已知粒细胞的发育包含从造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)/多能祖细胞（multipotent progenitors，MMPs）→常规髓系祖细胞（common myeloid progenitors, CMPs）→常规粒-巨噬细胞祖细胞(common granulocyte-macrophage progenitors，cGMPs)→粒-单核-树突细胞祖细胞(granulocyte-monocyte-dendritic cell progenitors，GMDPs)→早幼粒细胞(promyelocytes，PMs)→中幼粒细胞(myelocytes，MYs)→晚幼粒细胞（metamyelocytes，MMs)→杆状核粒细胞(band cells，BCs)→分叶核粒细胞(segmented neutrophils，SNs)→外周成熟中性粒细胞(peripheral mature neutrophils，PMNs)等一系列复杂的过程。虽有研究通过单细胞组学鉴定出人中性粒的各类前体细胞，但这些前体细胞都表达CD66b和CD15，其分化水平更趋近于PMs，而非更早的祖细胞。此外，有报道在小鼠的cGMPs中鉴定到最早的中性粒祖细胞CD34⁺Ly6C⁺CD115⁻ Pro-Neu1s。基于此，作者拟通过流式和单细胞多组学鉴定人骨髓中的NCPs。

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研究结果

BD流式细胞术助力粒细胞定向前体细胞NCPs发育

BD流式细胞术鉴定cGMPs亚群

为了鉴定出比早幼粒细胞更幼稚的中性粒定向祖细胞，采用流式抗体Panel对骨髓中低密度的细胞进行分析，发现SSC^loLin⁻CD45^dimCD10⁻CD38⁺亚群不同程度地表达CD34和CD45RA，其中CD34⁺CD45RA⁺的亚群也是CD135⁺，为cGMPs；通过CD123，CD65和CD115将其进一步细分为5个细胞亚群（1A）：

体外实验鉴定CD34⁺CD45RA⁺CD64dimCD115−亚群为中性粒定向前体细胞

流式分选出该细胞亚群、cMoPs和MDPs，分别进行体外培养。流式分型结果显示CD34⁺CD45RA⁺CD64^dimCD115⁻细胞亚群极大部分分化为CD66b+的中性粒细胞，极少数分化为CD14+单核细胞（1B）。

此外，通过表型和形态鉴定，发现CD34⁺CD45RA⁺CD64^dimCD115⁻亚群在体外培养7天分化的中性粒细胞大多为幼稚中性粒细胞（1D，1E），培养至14天则可完全分化为成熟的中性粒细胞。

以上结果表明，CD34⁺CD45RA⁺CD64^dimCD115⁻亚群为中性粒的定向前体细胞。

BD流式细胞术鉴定其他NCPs亚群

有研究发现NCPs也存在于CD45RA⁻的亚群中，为此通过BD流式细胞术对低密度的SSC^loCD45^dim亚群进行深入分析，发现可通过CD34和CD45RA将CD64^dimCD115⁻的NCPs分为4个亚群：

• NCP1s: CD64^dimCD115⁻CD34⁺CD45RA⁻

• NCP2s: CD64^dimCD115⁻CD34⁺CD45RA⁺（1和2中介绍）

• NCP3s: CD64^dimCD115⁻CD34^dim^/-CD45RA⁺

• NCP4s: CD64^dimCD115⁻CD34^dim/-CD45RA⁻

流式分选出以上亚群，并对其形态和发育潜能进行研究，发现CD34⁺和CD34^dim/-的NCPs为早幼粒细胞的“上游”细胞，且表达不同水平的CD45RA。

NCP1s和NCP2s体外培养可独立分化为中性粒细胞

为研究NCPs的发育过程，分选上述4种NCPs分别进行体外培养，流式分析表型，发现NCP1s（CD34⁺CD45RA⁻）可通过下调CD34的表达而直接分化为NCP4s（CD34^dim/-CD45RA⁻）；而NCP2s（CD34⁺CD45RA⁺）则是先下调CD34的表达分化为NCP3s（CD34^dim/-CD45RA⁺），随后逐步下调CD45RA的表达分化为NCP4s，最后都分化为CD66b⁺的中性粒细胞（3A，3B）。

单细胞转录组研究助力NCP发育谱系及轨迹分析

转录组测序发现NCPs比早幼粒细胞PMs更幼稚

通过Bulk-RNA测序，对NCPs，HSC/MPPs,CMPs,PMs,MYs,MMs,BCs,SNs,PMNs进行转录组特征分析（PCA分析）发现，NCPs的转录水平位于CMPs和PMs之间，且NCPs各亚群之间相互聚集（4A），其CD34和PTPRC（编码CD45）基因的转录水平也与流式结果一致（4B，4C）。

转录组测序和表型分析证实NCPs为eNePs，human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus的“上游”细胞

为验证NCPs是否位于最近文章报道的eNePs，human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus的“上游”，作者将NCPs PCA基因与已发表的转录组数据进行比较，发现NCPs比eNePs，human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus在转录水平上更为幼稚。且用流式表型分析验证了此结果。

BD单细胞多组学揭示NCPs异质性和发育轨迹

为精确剖析NCPs转录组的异质性，流式分选出NCP1s、NCP2s、NCP3s、NCP4s和cMoPs，混样试剂盒SMK对其分别标记后，上样BD Rhapsody单细胞平台，最终捕获17902个细胞，其分析结果如下：

1）

从非线性降维UMAP图中可看出，NCPs与cMoPs的转录水平存在明显差异，而NCPs之间分界不明显（7A）

2）

Seurat无偏倚聚类分析将细胞亚群分为9个Clusters（C1~C9）（7B），其中C1~C4为NCPs亚群（表达中性粒相关的基因，CEBPE，GFI1，ELANE），C5~C6则为cMoPs亚群（表达单核细胞相关基因，IRF8，CSF1R，FLT3）（7C）。

3）

分析C1~C4在各NCPs中的占比发现，NCP1s和NCP2s具有相似的C1~C4占比，且以C1为主；NCP3s和NCP4s具有相似的C1~C4占比，但以C3为主；此外，C2在各NCPs中的占比基本一致（8A）

4）

通过R语言Destiny函数包计算NCPs中每个细胞的拟时间值（8B），并评估他们的成熟程度，结果发现C1亚群以更幼稚的细胞为主；C3和C4则以较成熟的细胞为主，而C2则介于两者之间（8C）；此外，CD34主要表达于C1和C2亚群，与NCP1s和NCP2s的表型相吻合（8D）

5）

用Seurat对C1~C4的差异基因进行分析，并鉴定出136个关键基因。其中C1高表达未成熟的Marker基因（CD34, TOP2A，TUBB），C2高表达干扰素刺激基因（ISG15，IFI16，IFIT3），而C3和C4则高表达嗜天青颗粒相关基因、中性粒活化和脱颗粒相关基因（8E）

6）

通过拟时序评估C1~C4潜在的发育轨迹，发现其存在3条分支，其开始于C1并分化出2种发育轨迹：

轨迹1为从C1到C3和C4的分化，其涉及的基因与中性粒细胞颗粒酶相关（TOP2A，CSTG，BEX1），因此被成为“常规发育轨迹”；轨迹2为从C1到C2的分化，其涉及的基因大多为干扰素刺激基因（IFI6，IFITM3，IFIT3），因此被成为“干扰素刺激发育轨迹”（8E~8H）

以上数据表明，NCPs存在转录组异质性，且可通过2条不同的分化轨迹进行发育。

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全文总结

在本研究中，作者充分利用流式联合BD Rhapsody单细胞多组学技术势对骨髓来源的NCPs进行研究，结果发现NCPs可分为4种处于不同成熟阶段的细胞亚群，并通过2条不同的分化途径定向分化为CD66b⁺的中性粒细胞，且较之前报道的“早期中性粒前体细胞”更为幼稚。该方法为后续研究其他细胞发育轨迹、异质性和表型等提供了重要的研究思路。