NIR-II荧光团丨P800SO3-PEG：可肾清除的荧光团实现骨靶向成像治疗

2022-11-09 13:27:55, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：无创成像技术可以用于可视化骨生长、异常和代谢，同时在骨的图像引导干预和外科手术中发挥着重要作用。然而，目前还没有骨特异性NIR-II成像探针，能够实时无创检测骨生长和组织微钙化。本研究基于结构固有靶向(SIT)策略，设计靶向近红外荧光团用于骨组织的无创成像，其中靶向基团或药效团被纳入荧光团的化学结构中。我们对先前开发的近红外荧光团进行了改进，以生成一种肾脏可清除的骨靶向造影剂。该造影剂具有改进的光学性能和生物分布，此外还能产生光热效应(图1a)。通过在介碳中引入硫原子，最终荧光团的峰值发射波长转移到NIR-II范围内，对光照射的敏感性提高。

背景: 由于NIR-II荧光成像可穿透组织深处并减少散射，因此在检测骨生长、代谢、转移及其他骨相关疾病方面，NIR-II荧光成像优于常规可见和NIR-I荧光成像。而P800SO3-PEG对骨组织具有高亲和力，更深的组织成像能力，其在主要器官中最小的非特异性摄取以及对激光照射的光热效应，使其成为骨靶向治疗诊断成像的最佳选择。

方法: 首先，作者为了研究其稳定性与浓度的关系，将P800SO3-PEG溶于DI水中，在5%牛血清白蛋白(BSA)的生理盐水中制备不同浓度10~250μM的工作溶液。为了获得光稳定性，使用808nm激光二极管以35mW/cm2连续照射200μL的工作溶液，每30分钟成像一次，持续120分钟。通过测量感兴趣区域(ROI)并将荧光强度与起始荧光信号进行比较来确定其稳定性。之后作者为了测定其光热效应，在10mM DMSO染料原液中在1XPBS溶液中制备30μM的ICG、P800SO3和P800SO3PEG。以PBS作为对照。将500μL的工作溶液和空白PBS置于1mL试管中，用808nm激光二极管以1W/cm2的速度照射2分钟，用热成像相机成像。每15秒记录每个荧光团的热读数。

作者随后做了钙盐实验，将碳酸钙、草酸钙、羟基磷灰石、磷酸钙、焦磷酸钙盐(25 mg/mL)分别用5μM工作溶液置于1mL的生理盐水中孵育。将钙盐与荧光团在室温下连续旋转30分钟。然后用生理盐水洗涤混合物3次，然后以3000转/分离心10分钟，以除去未反应的荧光探针。为了比较其结合亲和力，作者将离心后收集的沉淀分散在200μL的生理盐水中，荧光成像系统测定分散样品的荧光强度。所有近红外荧光图像在相同的曝光时间下采集，并以相同的归一化显示。

实验动物选择了CD-1小鼠(6-8周，雄性)和无体型NCr nu/nu小鼠(6周)。作者为了研究每个近红外荧光团的生物分布和清除率，从10mM DMSO原液中提取0.25-1.0mM的含5%牛血清白蛋白(BSA)的生理盐水配制工作溶液，每个近红外荧光团100μL(25-100 nmol)经眶后窦静脉注射，术中近红外荧光成像后处死动物，切除主要脏器，包括心、肺、肝、胰、脾、肾、十二指肠、肠、肌肉等，并成像观察组织特异性生物分布。每个器官/肌肉上方感兴趣区域(ROI)的荧光强度使用ImageJ版本1.52 2p进行量化。信背比记为SBR。

作者为了测定近红外荧光团的组织分布，在CD-1小鼠注射了50 nmol的P800SO3PEG，在100μL的5%wt/vBSA/生理盐水后的第1天和第14天摘除骨组织。将解剖的组织裁剪并埋入组织-Tek最佳切割温度(OCT)化合物中，不进行预固定步骤，组织块在-80℃冷冻。用低温制冷机切割Tµm厚的冷冻切片。玻片先进行荧光分析，然后进行苏木精和伊红(H&E)染色。调整曝光时间以获得每个荧光图像相似的最大荧光值。作者还从匹配的视场中获得了h&e染色玻片的亮场图像。

结果: 骨靶向近红外荧光团的理化性质：如图1b所示，在P800SO3周围设计P800SO3-PEG，用血清稳定但灵活的硫醇PEG连接剂取代根草酸连接剂，导致最大吸收光谱和发射光谱的光束漂移，从而实现NIR-II尾迹成像。骨靶向近红外荧光团的理化性质见表1，分布系数对数D是血液中最终化合物的亲脂性和血清蛋白结合的重要预测因子，P800SO3-Cl是亲水性的，但通过在骨架上添加SH或PEG增加了亲水性，这分别将对数D降低到-7.04和-8.65。而拓扑极表面积（TPSA）是组织吸收和渗透的指标。而表2总结了在10%胎牛血清(FBS)中测定的骨靶向近红外荧光团的光学性质，P800SO3-Cl在817 nm处荧光最强，消光系数高。在同一七甲基氨酸主链的中碳上，氧取代导致荧光发射的低色移，而硫原子取代产生42-45 nm的浅色移，从而实现了NIR-II尾成像(图1e,f)。

图1

表1

骨靶向近红外荧光团的血浆蛋白结合，光稳定性和光热效应：首先是骨靶向近红外荧光团的血清稳定性，作者使用快速平衡透析(RED)装置测量了它们的血浆蛋白结合(PPB)(图1g)。在浓度为10µM的5%含牛血清白蛋白(BSA)生理盐水中制备近红外荧光团，在37°C温和振荡孵育8h。利用ICG作为对照。P800SO3-Cl和P800SO3-PEG显示约40%的PPB，而P800SO3和P800SO3-SH显著结合血浆蛋白(>70%)。作者为了测量了这些近红外荧光团在不同浓度(10-100μM)下的光稳定性，在自制的NIR-II成像系统下，使用功率密度为35mW/cm2的808nm激光照射2h，P800SO3和P800SO3Cl在>50µM时表现出较好的光稳定性。然后，作者在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定每个荧光团的浓度为30μM，并在808 nm激光下照射样品2分钟，以证明其假设，这些近红外荧光团显示光热效应如图1h所示。总的来说，在激光照射下，所有测试的近红外荧光团都观察到升高的温度变化(10-15°C)。其中，P800SO3-PEG和P800SO3-SH表现出最快的光热效应，这与图S3a中它们的光敏性结果一致。与P800SO3相比，P800SO3- peg的升温要高2-4℃，这可能是由于每个聚甲基链的电子密度和空间位阻的差异所致。

骨靶向近红外荧光团物理化学稳定性的测量：作者分别在DI水中制备1mM和5μM工作液，测定P800SO3-PEG的热稳定性和pH稳定性。P800SO3-PEG在-80~25°C的广泛温度范围内孵育8小时后显示了合理的热稳定性。

钙盐结合试验：作者进一步测量了NIR-I和NIR-II窗口（图2a）中NIR荧光团的荧光发射尾部，然后体外测试这些荧光基团结合生物相关钙盐的能力，包括羟基磷灰石（HA）、碳酸钙（CC）、磷酸钙（CP）、草酸钙（CO）和焦磷酸钙（CPP）。在人体内发现的五种主要钙盐中，HA是主要成分，也存在于动脉粥样硬化斑块和骨肿瘤中。通常，在测定中，没有荧光基团与CPP表现出强烈的结合。与其他3种荧光基团相比，P800SO3-Cl在NIR-I和近红外-II窗口内与HA的结合力更强，但其在HA、CC、CP和CO之间的结合差异很小。总体而言，NIR-II窗口中骨靶向药物的信号强度比NIR-I窗口中的信号强度高十倍。为了找到更详细的与钙盐的结合模式和形态，选择P800SO3-PEG并在近红外显微镜下观察。如图4所示，在HA、CP和CO中观察到较强的信号，但在CPP中几乎没有观察到任何信号，表明结合最小，这与图2b中的体外数据一致。

图2

骨特异性靶向：作者为了评估骨特异性结合以及生物分布和清除率，将50 nmol的每种NIR荧光团静脉内施用于CD-1小鼠，并在NIR-I和NIR-II窗口下成像，直到注射后4小时（如图3所示）。在成像之前，所有内脏器官都被切除，仰卧姿势被固定。所有注射的NIR荧光团都成功地突出了小鼠的胸椎，腰椎和骶椎，以及脊髓肋骨，髂骨和膝关节，具有高荧光信号（图3a，b）。P800SO3-Cl的LogD值相对较高，对HA的结合选择性较差，因此在肌肉和皮肤中表现出较高的非特异性摄取，导致三者中的SBR最低（NIR-I≈2.3，NIR-II≈3.9）。另一方面，P800SO3-SH由于在低浓度（<50μM）下光稳定性差，因此在骨骼和背景组织中显示出整体低信号。P800SO3-PEG呈现出最小的背景信号，整个骨骼结构清晰地凸显出来。

图3

生物分布和药代动力学：作者评估了P800SO3-PEG的药代动力学和排泄途径（图4a）。P800SO3-PEG迅速分布到全身，并迅速从血液中清除。不像P800SO3，P800SO3的间隙较慢。因此，P800SO3-PEG在曲线下显示小面积（AUC）和合理的清除率（0.23 mL / min），导致4小时内快速排泄尿（74%ID）。

无创NIR-II成像：在NIR-II窗口中，在测试的剂量范围内清楚地检测到颅骨，肩胛骨，脊柱，髂骨和部分股骨。在50nmol的剂量下获得22.0±1.3的最大平均SBR值。P800SO3-PEG通过肾脏清除进入膀胱而从体内消除，即使在最高剂量为100 nmol的情况下，非骨组织也不会对其进行非特异性摄取。图4c比较了静脉注射P800SO3-PEG后小鼠1天和14天的膝盖，颅骨，脊柱和尾巴的骨成像。放大的骨图像显示了组织中骨信号分布的变化。在膝关节中，骨骺和形骺是代谢活跃的区域，信号随着时间的推移而减少或消失，并重新分布到胫骨和股骨中。另一方面，生长板中没有信号，因为它是软骨组织。至于颅骨和上颌骨，随着时间的推移，边缘轮廓信号变得更加明显。后躯干的平面形状显示脊柱（包括胸椎、腰椎和骶椎）、髂骨和部分背肋骨。在NIR-II窗口下，棘突中的信号逐渐减少，而横向过程中的信号被保留。图4c还显示了非皮肤小鼠的精确尾椎成像。经过两周的沉积，每个尾锥都发出高信号强度，并且可以在视觉上分离。椎间盘中没有荧光信号，因为它是纤维软骨组织。第1天对纵向骨骼的H&E和显微分析显示骨表面的荧光信号（图4d）表明软骨（白色箭头），注射后第14天的成像显示P800SO3-PEG稳定地掺入骨基质（黄色箭头），随着时间的推移，额外的正常骨基质沉积在NIR荧光团的顶部。对松质骨的显微镜分析表明，该区域的周转率很高（即去除P800SO3-PEG标记的组织（蓝色虚线）和/或延迟新骨沉积（无荧光）。

图4

3D荧光层析成像：计算机断层扫描（CT）是最常见的成像方法，广泛用于在宏观和微观水平上提供骨骼图像。此外，由于广角（360°）采集荧光数据，3D荧光断层扫描提供了查看深层组织NIR荧光成像的机会。荧光发射计算机断层扫描（FLECT）/CT系统通过采集动物主体周围的360°投影图像并随后进行精确的图像重建，可以捕获真实的3D断层扫描图像。图5显示了在InSyTe FLECT / CT成像系统下通过3D荧光断层扫描P800SO3-PEG在各种骨组织中的体内分布。与其他组织相比，P800SO3-PEG在注射后4 d显示出明显的骨摄取。图5a显示了P800SO3-PEG在脊柱和骨关节中的积累。该数据还表明P800SO3-PEG优先积累在代谢活跃的骨骼区域。残余微弱的肾脏信号表明P800SO3-PEG的肾清除率稳定。冠状动脉和矢状面图像还显示P800SO3-PEG在膝盖，肩部和脊柱中大量积聚（图5b，c）。

图5

结论: P800SO3-PEG与骨基质具有高效快速的结合，并且由于由双膦酸盐和磺酸盐以及柔性硫醇PEG连接剂组成的平衡骨架，肾脏清除率相对较快。与我们之前报道的骨靶向药物P800SO3和其他基于双膦酸盐的NIR荧光造影剂相比，P800SO3-PEG具有几个优点：1）通过更高的SBR改善骨特异性靶向。2）最大吸收和发射光谱在800nm左右，与传统的NIR成像系统兼容。3）改进了NIR-II窗口下的无创成像。4）硫醇诱导的光热疗法治疗骨肿瘤，转移和传染病。此外，与主要保留在体内或显示缓慢肝胆排泄的典型NIR-II荧光纳米颗粒不同，肾透明P800SO3-PEG显示出快速排泄和良好的生物相容性，不会干扰肝脏，脾脏和其他器官。P800SO3-PEG对骨组织具有较高的亲和力，具有较强的组织成像能力，在主要器官的非特异性吸收最小，且具有激光照射下的光热效应，是骨靶向治疗成像的最佳选择。

参考文献

https://doi.org/10.1186/s40824-022-00294-2

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