景杰生物 | 报道

精子发生是一个高度复杂的生理过程，其异常将导致雄性不育。中心体作为精子重要的超微结构，参与精子鞭毛和头尾连接装置的形成，同时也是受精卵的主要微管组织中心。临床已发现精子形态异常引起的男性不育症大多伴有中心体功能缺陷，但直接的实验室证据有限。中心体蛋白是中心体的重要组成部分，目前研究已发现中心体蛋白与癌症、小头畸形、肥胖、糖尿病等症状有关，然而关于中心体蛋白功能障碍与男性不育的相关性研究非常有限。

四川大学华西第二医院沈英课题组在之前的研究中首次报道，中心体蛋白CEP128通过调节精子发生过程中关键基因表达，以及调控TGF-β/BMP信号通路重要分子的磷酸化，从而介导雄性生殖过程 (NC | 四川大学华西第二医院沈英课题组首次报道中心体蛋白CEP128影响精子发生和早期胚胎发育),该成果发表于Nature Communications (IF=17.6939)上。

近日，四川大学华西第二医院沈英、杨镒魟、汪燕教授联合北京师范大学陈苏仁教授在Science Advances (IF=14.9579)上发表了题为Loss-of-function mutations in CEP78 cause male infertility in humans and mice 的连续性工作成果。研究发现中心体蛋白CEP78功能丢失是导致男性不育的一个重要的因素，为中心体蛋白在生殖生物学过程中的作用提供了新的见解。景杰生物为该研究提供了TMT蛋白质组学分析技术支持。

中心体蛋白编码基因CEP78是视锥视杆营养不良伴听力损失综合征的明确致病基因，视锥视杆营养不良伴听力损失综合征属于神经退行性病变，患者主要表现为进行性黄斑受累，伴有视力丧失、色觉障碍、畏光和眼球震颤，以及感音神经性听力障碍。有报道称在视锥视杆营养不良伴听力损失综合征的家系中存在男性不育患者，然而是否视锥视杆营养不良伴听力损失综合征与男性不育存在相关性仍不明确。

研究人员通过全外显子测序发现三名男性不育症患者均携带一个CEP78基因的纯合剪切位点突变 (c. 1069+1G>A)。由于CEP78是视锥视杆营养不良伴听力损失综合征的明确致病基因，因此听力视力检测发现先证者存在轻度视觉听觉障碍。然而CEP78与男性不育症的关系并不明确，因此研究人员做了全面的精液分析，发现该突变携带者均表现为精子数量极低、精子形态完全异常以及精子活力几乎为零。同时，精子的中心体结构严重缺陷。

图1 CEP78的功能缺失突变导致男性不育

为进一步解析中心体蛋白CEP78对哺乳动物精子的发生、分化和成熟的重要作用，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了Cep78基因敲除小鼠 (Cep78 KO)。研究人员发现雄性Cep78 KO小鼠表现出与患者相似的不育表型，即精子数量显着减少，精子活力大大降低、形态极度异常。进一步光学显微镜及扫描电镜观察显示Cep78 KO小鼠精子呈现出严重的形态缺陷，包括缺失、卷曲、短和不规则的鞭毛，以及异常的头部形状。透射电镜提示精子微管缺乏或紊乱及核发育异常，同时缺陷的中心体在精子发育过程异常明显。以上结果说明， CEP78对精子发生至关重要，它的缺失可能导致生殖细胞的中心体发育缺陷，从而导致雄性不育。

图2 Cep78 KO小鼠的精子发生受损

为了探索CEP78调节精子发生的分子机制，研究人员使用了蛋白质组学方法对WT小鼠和Cep78 KO小鼠的睾丸进行了研究。共鉴定到5367个蛋白，包括90个差异上调蛋白质和237个差异下调蛋白。GO 富集分析显示下调的蛋白与鞭毛发生和纤毛发生以及其他参与精子发生的过程有关，例如减数分裂I，精子细胞分化，顶体囊泡等，上调蛋白与凋亡途径相关。其中，Tektins蛋白家族下调最为明显。

Tektins蛋白家族在精子鞭毛形成中具有至关重要的作用，因此研究人员进一步探讨CEP78如何通过调控Tektin蛋白家族介导精子发生。WB检测结果显示Cep78 KO小鼠中Tektins的表达降低，与蛋白组学结果一致。同时在hRPE1细胞上敲除CEP78后，发现Tektins表达均下调。有研究提示Cep78特异性结合EDD-DYRK-2DB1VprBP并抑制其活性，以介导CP110蛋白的泛素化，从而调节中心粒长度和纤毛组装。因此，研究人员推测CEP78可能通过泛素化途径调节Tektins表达。有趣的是，研究人员发现与WT小鼠相比，在Cep78 KO小鼠睾丸组织中观察到Tektins的泛素化降解明显增加。

为明确CEP78抑制Tektins泛素化降解的机制，研究人员分析了KO和WT小鼠之间差异表达的E3泛素连接酶或去泛素化酶。在已鉴定的差异表达蛋白中，研究人员仅检测到两种去泛素化酶：USP16和MINDY2。MINDY2参与蛋白K48连接的去泛素化，但有趣的是，USP16参与中心体和微管相关功能，表明USP16和CEP78之间存在潜在关系。研究人员进一步通过Western blotting和免疫荧光染色证实，与WT小鼠相比，KO小鼠睾丸中USP16表达明显降低。为进一步阐明CEP78通过与USP16的相互作用调控Tektins表达，研究人员在hRPE1细胞中敲掉CEP78以后，发现USP16表达丰度随之下降，反之亦然。Co-IP进一步明确CEP78与USP16存在相互作用。因此，以上结果提示USP16丰度可能受其与CEP78的相互作用调节。

为明确Tektins的表达是否受去泛素化酶活性的调节，研究人员用去泛素化酶抑制剂PR-619处理hRPE1细胞8小时，结果发现随着PR-619浓度增加，Tektins降解随之增加，因此，去泛素化酶可以有效的抑制Tektins的降解。研究人员进一步证实敲除USP16以后，Tektins降解增加，反之亦然，且USP16与Tektins存在相互作用。为了证实USP16敲低对Tektins表达的影响是通过蛋白酶体降解途径介导的，研究人员用蛋白酶体抑制剂MG132的处理转染了USP16被敲除的hRPE1细胞，结果发现蛋白酶体抑制可部分挽救USP16降低所致的Tektins降解。此外，研究人员分析了USP16对Tektins泛素化的影响，发现USP16的下调显著增强了内源性Tektins的泛素化，反之亦然。综上，CEP78通过调节去泛素化酶USP16的表达来抑制泛素化介导的Tektins降解而调控精子发生。

图3 CEP78通过调节USP16介导的 Tektins功能参与精子发生过程

综上所述，本研究具有显著的创新性和重大的科学意义，为证实中心体蛋白在男性生殖过程发挥重要作用这一推论提供了有力的证据：截至目前，仅有两个中心体蛋白被提示与人类男性不育症相关，且详尽功能未阐明。由此，生精细胞是否具有特异的中心体蛋白以调控减数分裂， 在精子发生、 鞭毛生成及中轴体形成形中起何作用？本研究解决了这些悬而未决的科学问题，明确了中心体蛋白在男性生殖过程中所起的关键作用，为中心体蛋白参与男性生殖提供了有力的证据；同时揭示了中心体蛋白功能异常是造成男性不育的一个重要因素：明确CEP128基因突变是精子发生障碍及胚胎发育阻滞新的发病机制，为男性不育症的遗传学诊断提供有力的证据。此外阐明了中心体蛋白在精子发生过程中的重要功能及相关分子机制，以期为男性不育症治疗研究提供新思路与新方向。

图4 CEP78参与精子发生和胚胎发育的作用机制图解

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参考文献

1. Xuegang Zhang, et al. 2022. Loss-of-function mutations in CEP78 cause male infertility in humans and mice. Science Advances.

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