液相色谱系统选择性变化的诊断分析

遵循检查清单可以帮助诊断色谱选择性的变化，这可能是最难分离和校正的色谱柱。

分析系统的选择性（α）描述了根据化学和物理–化学性质的差异来区分样品成分的能力。用色谱法术语，它描述了色谱图中峰的顶点之间的间隔（图1），不仅由分析物的性质决定，而且由固定相和洗脱液系统的性质决定。

通过分析方法获得的选择性对于色谱分离至关重要，并且与峰效率（粗略地是峰宽）结合使用，将决定色谱图中峰的分辨率。当选择性变化，分辨率可能降低，使得峰面积测量不够精确和可重复的，以及减少在峰识别或光谱结构鉴定的信心。

选择性的变化范围从色谱图中单个峰的相对保留的细微变化到每个峰的整体保留顺序交换，我们需要能够发现这些变化并以系统和熟练的方式调查原因。但是，由于影响选择性的因素太多，有时很难知道从哪里开始我们的诊断研究。

上图显示了色谱选择性（峰1和峰2）发生细微变化的示例，对于峰的准确定量存在一定的困难。

可以看出，选择性变化还伴随着向稍后保留的轻微变化，当发生保留变化时，最好检查相关峰的选择性值以确认是否发生了选择性变化。在这种情况下，从视觉上看，我们已经改变了系统的结构，因此，我们将继续进行操作，并调用选择性诊断清单来调查问题。

请务必注意，检查清单的顺序是“简单且易行”，例如，检查清单中较早包含易于检查的内容，以使我们的调查尽可能高效。

1 检查方法的梯度曲线

检查是否已将正确的梯度曲线输入到色谱数据系统（CDS）采集方法中。如果需要，输入正确的梯度曲线，然后重新分析样品或标准溶液。

2 确认正确的固定相

色谱柱固定相显然对分离的化学过程至关重要，我们的第一个诊断方法是检查色谱柱是否正确（包括色谱柱尺寸）。请注意，即使在标称固定相化学性质（例如C18）相同的情况下，在品牌或制造商之间切换时，发生选择性变化也是很常见的。确保仅使用规定的阶段和制造商

对于该方法，除非事先已经建立并验证了相位等效性。如果需要，请更改为正确的列，然后重新分析样品和标准溶液。

3 检查固定相的批次和批号是否与之前的“良好”分离相对应

某些（通常是较旧的或更复杂的）固定相的选择性可能在批次或批次之间发生变化，这是由于制造（键合）化学的细微或不可控制的变化所致。如果使用不同的色谱柱硬件（管或玻璃料等），选择性变化也可能发生。验证批次和批号，如果不同，则从同一批次开始寻找色谱柱，但此时不要更改色谱柱。

4 验证正确的色谱柱温度

色谱柱（洗脱液）温度的变化会影响分离的选择性，这在处理离子源分析物时会更加明显（如上述示例中的情况）。确保在CDS中选择了正确的柱温箱温度，并使用热电阻温度计（RTD）在柱加热器中建立了正确的温度。有时有必要调整所选的柱温箱温度以获得使用RTD测量的正确温度值。同样值得注意的是，各个制造商之间的洗脱液预热选项之间的差异。一些系统使洗脱液流过色谱柱隔室金属织物内的小空隙，以将洗脱液预热至所需的色谱柱温度。即使预热段液压路径的体积差异很小，也会影响非常敏感的分离的选择性，因此，应牢记高效液相色谱（HPLC）系统制造商之间的差异。确保设置并达到正确的色谱柱和洗脱液温度，然后重新分析样品或标准溶液。当怀疑温度是造成选择性差异的原因时，“最后的选择”检查是将分离方法切换为已知可使用所研究方法进行良好色谱分离的系统。

5 检查流动相pH

在分析离子源分析物时，洗脱液的pH值可能会对分离的选择性产生很大的影响，在某些情况下，洗脱液pH值的很小变化会导致较大的选择性差异。请牢记使用校准过的pH计的最佳实践方法。确保pH值正确到两个小数位以内或至少在方法中指定的小数位数以内。请记住，当使用挥发性流动相添加剂（甲酸，三氟乙酸，氨水等）时，该添加剂可能会在长时间的分析过程中损失掉，因此pH值可能会随时间“蠕变”。尝试通过指定是否以重量/体积（w / v）或体积/体积（v / v）的方式添加pH调节添加剂来避免洗脱液制备中的错误（例如0.1％的甲酸v / v而不是仅添加0.1％的甲酸） ％甲酸）。重量分析制备洗脱液系统是最好的策略，也是最准确的。

6 检查洗脱液的洗脱强度和缓冲液浓度

确保已使用正确的有机改性剂溶剂，并在CDS方法中选择了正确的溶剂通道。在预混合流动相的地方，请确保在混合之前分别测量每个体积，以避免由于混合潜热而引起的体积变化或不准确。当使用甲醇作为有机改性剂时尤其如此。确保使用了正确的缓冲盐，pH调节剂或添加剂（例如，正磷酸氢二钠的色谱特性与正磷酸二氢钠不同），并确保使用了正确重量或体积的添加剂。如前所述，需要检查添加剂是按体积对体积还是按重量对体积指定。一旦进行了这些检查或准备了新鲜的洗脱液，请重新分析样品或标准溶液并检查选择性。如果您设法从与原始色谱柱相同的批次或批号中获得了HPLC色谱柱，那么现在是尝试新色谱柱并进行评估的好时机。

同样，请注意，任何挥发性洗脱液添加剂在放置时都可能蒸发，这可能会影响长时间的分析活动或允许将洗脱液静置在仪器上的批次之间的保留和选择性。

7 检查仪器之间的停留体积差异

在梯度HPLC中，洗脱液混合方式的差异（二元泵与四元泵系统），或在洗脱液混合至分析物顶部之间的系统体积之差色谱柱会导致保留时间和分离选择性的差异。为特定方法在HPLC系统之间切换时，需要验证是否已解决了这些固有的系统差异。这通常是通过在梯度的初始部分添加等度保持，甚至通过引入注入延迟来实现的，从而在梯度开始后的某个时间注入样品。基础理论和纠正措施的详细信息可以在参考文献3中找到，但是，此问题比通常认为的更为典型，因此，如果已执行所有其他清单项目，则将色谱柱和洗脱液系统切换为系统最后一次令人满意的分离将在其上指示驻留体积差异问题。

8 验证梯度混合和输送的准确性和功能

有时仪器会有点破旧，以准确或可复制的方式混合梯度的能力会降低。在这种情况下，尝试使用其他工具可能是短期内最简单的解决方案。四元泵比二元泵更容易出现梯度混合不准确的情况，二元泵比基于时间差流量或活塞冲程量提供正确洗脱液组成的二元泵更容易出现梯度混合不准确的情况。有多种测试可确定四元混合阀的有效性，但最简单的方法是在洗脱液（通道B）中加入0.1％v / v丙酮，并在“步骤”中设定的梯度过程中测量268 nm处的UV响应。每段20％”，例如10％B持续5分钟，每分钟10％B直到7分钟，在20％B保持5分钟，依此类推。如有必要，请更换混合阀，并注意，有时由于沉降片和洗脱液容器内过滤器的堵塞而引起的气穴现象可能导致洗脱液混合问题。还应按照制造商建议的清洁程序，在必要时定期清洁这些组件。

有时，在对通道梯度进行编程时，我们有时会有些过于自信，这些梯度仅在几分钟甚至几秒钟内就可以在很大范围的洗脱液B中上升（可以说，目前正在研究的方法属于此类）。除非我们使用的是效率最高，死体积最小的泵送系统，否则仪器可能无法准确或可再现地提供所需的梯度。同样，对该主题的详细处理超出了我们此处讨论的范围。

在我们的示例中，我们遵循清单5，发现洗脱液制备中存在错误，该洗脱液是按体积而不是按重量进行制备的。量取体积分数为0.01％的甲酸，水溶液的pH值为3.22，而重量法则溶液的pH值为3.27。尽管0.05个pH单位的差异似乎很小并且没有意义，但是当洗脱液的pH值非常接近目标分析物的pKa值时，这会导致色谱选择性的变化。与上次运行该方法相比，从新鲜洗脱液中获得的分离物如图3所示。此处要说明的另一点是，应尽可能在方法上设计洗脱液pH距目标分析物的pKa值至少1（最好是2）个pH单位。毫无疑问，开发此方法的分析人员使用了精细控制pH值来实现这种相当困难的分离方法，但是，也许更好的方法是使分析物处于完全电离或非电离的形式，并寻求替代的色谱柱，化学方法和有机改性剂获得令人满意的分离效果。

应当指出，我们还研究了所用仪器的梯度输送性能，并且梯度曲线的准确性和可重复性令人满意，因此，这被排除为潜在问题。

总之，色谱选择性的变化可能是最难诊断和纠正的。应该正确地确定选择性已经改变，并且上面概述的诊断清单的实现代表了一种逻辑且省时的方法，在该方法中可以隔离并最终纠正分离化学的问题。在可能的情况下，色谱分离的设计应考虑到稳定性，而在不可能的情况下，应仔细编写方法说明以突出分离条件内的关键变量。