三年磨一剑: 4D蛋白组再升级！4D-FastDIA强势来袭

2022-10-12 12:27:52, 景杰生物杭州景杰生物科技股份有限公司

离子淌度分离 (ion mobility) 的引入，使得蛋白质组学步入了4D新时代，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升，极大推动了蛋白质组学技术发展与广泛应用。

三年磨一剑！值此景杰生物4D技术平台三周年之际，景杰生物基于对行业需求洞察及超万例的蛋白质组分析经验基础上，升级推出全新一代4D-FastDIA蛋白组定量技术服务产品。该技术服务延续了4D蛋白组无需肽段分级和高深度的特征，进一步结合4D-DIA策略，降低缺失值，提高定量的稳定性与平行性，尤其适用于大规模蛋白质组学定量分析。

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全新一代4D-FastDIA集众多先进技术于一体，可谓是4D蛋白组的全面升级更新。今天我们邀请了景杰生物产品经理，对此进行详细的解析。

1. 全新一代4D技术平台：高扫描速度，高鉴定深度，更具性价比

2. 4D-DIA采集策略：显著降低缺失值，提升定量重复性与数据完整度

3. 离子淌度4D对齐：dia-PASEF技术，4D对齐提升DIA数据质量

4. 深度神经网络搜库策略：无需额外建库，高解析度获取可靠蛋白信息

1. 什么是4D蛋白质组学？

基于质谱的蛋白质组学定量，其原理为利用质谱检测样品离子的理化性质，根据样品的一级和二级质量谱图和相关信息等得到蛋白定性定量结果。4D蛋白组学是在传统3D即保留时间 (retention time) +质荷比 (m/z) +离子强度 (intensity) 这三个维度基础之上增加了第四个维度--离子淌度的分离。同时结合timsTOF Pro大幅度提升的扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组分析在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

图1 新一代4D蛋白质组学

2. 4D有什么优势？

4D蛋白质组学的特征之一是新增的双TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry，捕获离子淌度)，主要是根据分子的形状和截面进行分离，能够区分m/z一致的共洗脱多肽，从而产生唯一性的质谱二级谱图，许多在3D条件下中被掩盖的低丰度蛋白信号能够被快速高效区分和识别出来，极大提高检测灵敏度 (图2)。

图2 TIMS带来更高专属性和灵敏度

此外，timsTOF Pro质谱仪具备其独有的平行累积连续碎裂PASEF (Parallel Accumulation Serial Fragmentation) 扫描模式。母离子选择与TIMS中离子的释放同步进行，扫描速度高达100 Hz，可对低丰度的母离子进行智能叠加选择，可以实现近乎100％的离子利用率，并且带来扫描速度革命性的提升 (图3)。在相同的定量条件和微量样品量下，4D技术可以鉴定到多50%-100%的蛋白质或修饰位点。

3. DIA是什么？为什么选择DIA策略？

质谱采集模式分为数据依赖采集 (Data-dependent acquisition，DDA) 和数据独立采集 (Data-independent acquisition，DIA)。DDA数据采集模式下，在全扫描质谱图中，肽段离子按照一定规则进行筛选和富集，以获得较高的检测灵敏度，不过同时会伴有一定的随机性。而DIA则是将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，并循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，缺失值更少，提升定量重复性与平行性，更加有利于在大队列研究和高异质条件下对蛋白质进行稳健和准确的量化。

图3 DDA和DIA数据采集策略比较

4. 4D-DIA和传统DIA的区别

DIA策略通过通过开大窗口采集整个区间的所有信号，实现数据的“无损采集”，来避免随机性所导致的不平行问题，在大队列、高通量分析中有更佳表现。但这直接导致的一个问题就是：谱图的混杂程度极高，一方面导致灵敏度有所降低，还会导致谱图的解析异常困难！因此从2004年Ruedi Aebersold开发DIA技术以来，众多科学家围绕DIA策略，开发了一系列方法，以期解决DIA谱图复杂和后期数据解析的难题。

图4 传统DIA的主要特征和困难

2020年，全球蛋白质组领域顶尖科学家Matthias Mann教授团队与Ruedi Aebersold教授合作开发了基于4D平台的DIA技术——dia-PASEF®。

图5 基于4D平台的DIA技术——dia-PASEF®

在dia-PASEF的扫描模式下，与离子淌度相关的CCS值和m/z之间有一定的相关性，因此四级杆可以利用这个特征逐步扫描来实现近乎100%的离子信号，极大提升检测的灵敏度和深度（图6）。除此之外，dia-PASEF中新增加的离子淌度维度，有效降低了谱图的复杂性，解决了DIA技术中面临的最大困境。基于离子淌度的二次分离和CCS数值的对齐，进一步提高了检测灵敏度同时增强了定量的可靠性。

图6 基于4D平台的dia-PASEF®技术提升检测灵敏度与定量可靠性

a, dia-PASEF®中的数据采集模式；b, dia-PASEF®和DDA及传统DIA离子利用率的对比

4D-FastDIA结合了4D蛋白组+dia-PASEF+深度神经网络搜库的众多权威技术，进一步提升了蛋白质组分析的深度、重复性与稳定性。我们的实测数据显示，4D-FastDIA鉴定深度在4D-LFQ (DDA) 基础上进一步提升 (图7上)，三次重复共鉴定到6299个蛋白，其中overlap蛋白占比为97.4% (图7左下),技术重复性高达Pearson 0.99。对比DDA数据 (通常85-90%)，数据完整度提高，缺失值显著下降。

图7 4D-FastDIA蛋白组项目数据

此外，4D-FastDIA在磷酸化修饰组分析中也表现不俗，进一步提升了组学定量的平行性与稳定性。实测项目数据显示，样本间磷酸化位点overlap占比为80.0%，技术重复性高达Pearson=0.98。

图8 4D-FastDIA磷酸化修饰组学数据

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4D-FastDIA延续了4D蛋白质组学平台在采集速度与灵敏度的大幅度提升，实现了蛋白的深度覆盖。采取4D-DIA数据采集策略，提升平行性与稳定性，展现了在大队列样本分析中的卓越稳定性。基于深度神经网络的搜库策略，实现高可靠度高解析度提取肽段信息。特别适用于大队列样本蛋白组分析。

参考文献

1. Florian Meier, et al. 2018. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics.

2. Ludwig C, et al. 2018. Data-independent acquisition-based SWATH-MS for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol.

3. Meier F, et al. 2020. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods.

4. Mehta D, et al. 2022. BoxCar and Library-Free Data-Independent Acquisition Substantially Improve the Depth, Range, and Completeness of Label-Free Quantitative Proteomics. Anal Chem.

5. Demichev V, et al. 2020. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods.

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