生信分析系列干货 | 高分文章蛋白质组学数据预处理方法调研报告

1 DIA数据预处理流程

目前DIA蛋白质组学数据主要有两种常见的预处理流程：Spectronaut搜库策略和DIA-NN搜库策略。首先来看下Spectronaut搜库策略：

图 2 spectronaut搜库策略的预处理流程

从调研结果可以看出，不论是蛋白质组学还是翻译后修饰组学，也不管是在血液、组织还是细胞中，数据预处理的方式大同小异。以Matthias Mann课题组2022年在《Nature Medicine》中发表的文章（PMID: 35654907）为例，组织来源和血浆来源的DIA蛋白组学数据分别通过Spectronaut v13和Spectronaut v15.4搜库获得肽段和蛋白的相对定量信息，并对其进行log2的转换。随后进行缺失值的过滤和填充，在该项研究中，研究人员通过正态分布的随机值对样本中的缺失值进行填充，填充后的数据进入下游的统计和生物信息的分析。但该研究中并没有提及数据标准化的方式和批次效应问题，在我们调研的其他工作中（图2），在log2转换后和缺失值处理前，可能需要对数据进行样本内的中值标准化，使不同样本的数据分布处于同一水平，便于进行样本间的差异蛋白比较。去除批次效应，一般采用常见的Combat方式即可。

对DIA-NN搜库策略而言，其数据预处理方式与Spectronaut类似，在DIA-NN搜库得到相对定量值后先进行log2转换、数据标准化、缺失值处理等过程，最后进行差异蛋白的鉴定（图3）。

图 3 DIA-NN搜库策略的预处理流程

2 Label Free数据预处理流程

Label Free蛋白组数据的搜库方式与DIA数据有所不同，从调研的15篇文献结果中可以看出，其搜库方式主要有两种：Maxquant和Proteome Discoverer。

图 4 Label Free数据Maxquant搜库策略预处理流程

Maxquant搜库结果会得到3种定量值：Intensity、iBAQ、LFQ intensity。Intensity是将某Protein Groups里所有Unique和Razor peptides的信号强度进行加和，作为一个原始强度值。而iBAQ是在此基础上，除以某个蛋白的理论肽段数目，有点类似于长度标准化；LFQ则是将原始强度值在样本之间进行校正，以消除处理、上样、预分和仪器等造成的样本间误差。所以，iBAQ可以用于样本内进行比较，而LFQ用于样本间比较。无论是Intensity、iBAQ和LFQ，在后续定量分析中，一般都会进行log2转换、样本内中值或者quantile标准化，随后进行缺失值的过滤和填充，最后进入差异定量分析（图4）。Proteome Discoverer(PD)搜库默认定量值为iBAQ，一般常用的标准化方式为FOT（Fraction of Total），即用样本内所有蛋白的iBAQ总和进行标准化，然后基于标准化后的数据分布，选择10e-5或者10e-8等进行缺失值的填充，有点类似于最小值填充，随后进行下游数据分析流程（图5）。

图 5 Label Free数据PD搜库策略预处理流程

3 TMT数据预处理流程

在大样本尤其是临床大队列样本研究中，TMT 标记的蛋白质组学技术应用较多，从调研的25篇文献中（图6）可以看出，其搜库方式也较为丰富。除了Maxquant、PD外，MSFragger和MS-GF+也是比较常见的搜库方法。

图 6 TMT蛋白组数据调研信息

这里我们仅以MSFragger搜库策略为例，展示TMT蛋白组数据的预处理流程（图7）。一般而言，MSFragger先对原始蛋白组数据进行搜库，得到pepXML格式的搜库结果文件，随后利用Philosopher工具包进行肽段、蛋白和翻译后修饰的定量和过滤等处理。首先，MSFragger的输出结果可以通过PeptideProphet进行肽段的鉴定和验证，对于修饰组如磷酸化修饰组数据，可以在PeptideProphet输出结果的基础上通过PTMProphet进行修饰位点的鉴定。而对于蛋白的鉴定，则可以通过ProteinProphet进行处理。最后，利用Philosopher进行FDR的过滤和定量，获得肽段水平、修饰水平或者蛋白水平的TMT reporter ion intensity。但是，每个样本中所有蛋白的相对定量值，需要基于参考通道的样品进行校正，即将某个样本中蛋白的TMT reporter internsity值与参考通道样本中该蛋白的intensity值的比值（TMT ratio）作为该蛋白的相对定量值。

图 7 MSFragger搜库策略的数据预处理流程

在获得每个蛋白的TMT ratio值后，进行log2转换，并进行样本内的中值标准化过程。不过，该过程也并非简单的用TMT ratio值除以中值，而是经过了多重数据转换过程（图8）。首先计算每个样本的TMT ratio中值，并计算所有样本的全局中值M0；随后按照常规分析策略，用各自样本的中值标准化，在此基础上计算每个样本的绝对中值偏差MAD，并获得所有样本的全局绝对中值偏差MAD0；最后再基于M0和MAD0对蛋白相对定量值进行标准化。你以为这就结束了么？我们刚才提到了参考通道的蛋白相对定量值，最终蛋白质的相对表达值A表示为标准化后的蛋白定量值（取完log2转换）加上对应参考通道蛋白值（取完log2转换），随后进行缺失值处理、批次效应去除和下游的差异表达分析等过程。

图 8 TMT蛋白组数据的标准化流程