2022-09-01 02:06:50, 天美 天美仪拓实验室设备(上海)有限公司
背景简介
分子信标探针是核苷酸序列(DNA 和 RNA 的组成部分),用于荧光检测特定 DNA 或 RNA 序列的存在。分子信标(图 1)的设计使得序列末端的少量核苷酸碱基(5 到 7 个)彼此互补并配对形成所谓的茎。茎的形成产生了一个未配对碱基的环,称为茎环或发夹环。最后,在核苷酸序列的一端有一个共价连接的荧光团,而在序列的另一端有一个荧光猝灭剂。当分子信标处于这种发夹形式时,猝灭剂通过 Förster 共振能量转移 (FRET) 猝灭极大地减少了荧光团的荧光。
图1:分子信标探针
与分子信标具有互补碱基的核苷酸序列称为互补 DNA (cDNA)。在cDNA 存在的情况下,分子信标发夹将打开并与 cDNA 杂交形成双链序列(图 2)。这种杂交导致猝灭剂和荧光团进一步分开,从而荧光团发射不再被猝灭。通过监测来自荧光团的荧光变化,可以识别和量化 cDNA 的存在。
图2:分子信标和cDNA之间的反应,其中a)是cDNA,b)分子信标,c)杂交双链序列。
分子信标探针可以定制设计以靶向特定的 DNA 或 RNA 序列,从而允许分子信标用于 DNA 和 RNA 的实时检测和定量。主要用于PCR 定量、体内 RNA 检测、病原体检测、病毒载量定量和研究核酸-蛋白质相互作用。分子信标的使用,加上灵敏的荧光光谱仪和样品温度控制,有助于测量极低浓度的 DNA 或 RNA。
实验设置
分子信标探针及cDNA 购自于默克公司。所有数据均从配有 SC-27 (4位温度控制样品模块) Edinburgh Instruments FS5 荧光分光光度计获得。SC-27 用于在单独搅拌的同时加热四种具有不同浓度 cDNA 和分子信标的溶液。配置100 nM 的分子信标以及0 nM、20 nM、40 nM 和 60 nM cDNA 溶液。
图3:FS5荧光光谱仪与SC-27样品架
发夹开口的温度依赖性
cDNA和分子信标之间的杂交可以在信标处于闭合发夹形式时发生,但会缓慢进行。可以通过加热分子信标以打开发夹结构来加速杂交。当加热时,发夹结构的茎碱基对之间的吸引力被克服,这被称为变性,并且发夹打开。可以使用温度依赖性荧光研究此开口的温度依赖性(图 4)。
图4:不同温度下的分子信标荧光强度
使用温控样品模块时,FS5 Fluoracle ®软件可以自动获取温度图。荧光温度图(图 4)是通过在每个温度下加热样品 20 分钟同时搅拌以确保样品均匀加热而获得的,20 分钟后,在移动到下一个温度之前测量发射光谱。可以看出,由于发夹开口和 FRET 猝灭的减少,荧光强度随温度增加而增加。实验数据发现 60°C 是发夹完全打开的适当温度,60°C 时的荧光强度是 20°C 时的 50 倍。基于这些结果,选择 60°C 作为 DNA 检测的孵育温度。
DNA检测
将具有不同 cDNA 浓度的分子信标的四种溶液移至比色皿中并放置在 SC-27 的四个位置。为了促进 cDNA 和信标序列的杂交,将溶液通过在 60°C 加热并在该温度下保持 20 分钟进行温育。然后冷却回 20°C 并在该温度下再保持 20 分钟。这种加热和冷却的孵化过程增加了分子信标和 cDNA 之间的杂交率,如图 5 所示。
图5:SC-27中的cDNA和分子信标杂交孵化程序示意图。
孵育后四种溶液的荧光光谱依次进行测量,如图 6 所示。SC-27 可以自动测量具有相同测量参数的四种样品。可以看出,即使没有任何 cDNA 存在,仅分子信标溶液也显示出其特征发射,这是由于少量荧光团在溶液中游离。随着 cDNA 浓度的增加,由于信标与 cDNA 杂交并且信标上的荧光团未淬灭,因此荧光强度增加。
图6:在不同浓度的cDNA存在下,分子信标溶液的荧光光谱
已知 cDNA 浓度的样品的荧光强度可以建立荧光强度和 cDNA 之间的数学相关性。使用 Fluoracle ®的定量分析功能,图 6 中的测量值用于创建校准曲线,将 516 nm 峰的发射强度与 cDNA 浓度相关联(图 7)。
图7:cDNA浓度趋势分析
发现 cDNA 浓度和荧光强度之间存在以下线性关系:
Y = 1.076 × 105 + 6.024 × 102 X
其中 Y 是 516nm 处的荧光强度,X 是 cDNA 浓度,单位为 nM。
根据这种数学相关性,未知样品中 cDNA 的浓度可以通过其荧光强度确定。为了证明这一点,对具有 100 nM 分子信标浓度和未知 cDNA 浓度的样品进行孵育,并测量 516 nm 处的荧光,其cDNA 浓度为 27 nM(图 8)。
图8:cDNA已知浓度样品(橙色点)和未知cDNA浓度样品(红圈)的校准曲线。
结 论
Edinburgh Instruments FS5 荧光分光光度计用于使用分子信标探针以nM量级确定未知浓度的 DNA,与此同时,使用 SC-27 四位温度控制样品模块孵育 DNA 和探针溶液,并自动测量四种溶液的荧光强度,最后使用 FS5 Fluoracle ®软件的定量分析功能分析测试结果。
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