DI 应用分享 (一) ｜基于肽库的亲和力筛选，mapping蛋白结合位点

2022-08-11 14:37:31, NanoTemper 诺坦普科技（北京）有限公司

前

言

蛋白相互作用 (protein-protein interactions，PPIs) 是我们了解生理和病理的基础。线性短模体 (Short Linear Motifs) 会影响PPIs，从而在免疫识别、信号转导和调控方面发挥重要作用，也为药物干预提供了有吸引力的研发起点。

为了鉴定在结合中起到重要作用的肽段，研究人员通常会借助生物物理的方法进行亲和力表征及肽库筛选。但测定方法往往受限于孵育、通量、灵敏度、样品消耗量等因素，无法检测到结合或得到假阳性结果。

技 术 应 用


NanoTemper

高通量筛选和分子互作平台（DI）

NanoTemper推出了高通量筛选和分子互作平台DI，使用了高通量筛选技术：温度依赖的荧光强度变化(TRIC)。弥补了SPR、BLI、ITC、FP技术在进行小分子或多肽的筛选实验时，需要固定标记蛋白、筛选及检测效率低、样品消耗量大等不足。

 

2020年，研究人员使用TRIC技术，在蛋白与肽的亲和力测定领域取得了新进展。TRIC技术在实验设置上十分灵活，可以提供竞争结合实验的设置选择来完成筛选。通过准无标记的竞争实验设置，无需固定蛋白，即可快速、准确鉴定和mapping蛋白相互作用位点。竞争实验结果重复性好，可用于测定大亲和力范围的未修饰肽库的结合亲和力。

 

研究结果发表在iScience杂志，以下为您详细解读。


研究解读


使用与蛋白结合的标记多肽作为tracer，通过检测待筛选多肽的竞争性结合设置筛选实验（图1），这种设置方式，为研究人员提供了一种强有力的筛选和亲和力检测，且只需标记一个tracer多肽即可。


图1：基于TRIC的竞争结合实验，实验的信噪比很好

为了验证geph与GlyR b和GABAAR a3 subunit的结合位点，研究人员准备了一个由15个肽段组成的重叠肽库，每个肽段偏移了一个氨基酸，如第一个肽段为GlyR b或GABAAR a3 subunit蛋白的1-15aa，第二个为GlyR b或GABAAR a3 subunit蛋白的2-16aa，这样可以遍历GlyR b和GABAAR a3两个蛋白的序列，找到两个蛋白与grph结合的肽段和起到重要作用的氨基酸。


此次筛选对象是多肽库，使用标记的tracer，无须标记蛋白和待筛选多肽（图1）。通过亲和力筛选，确定图2中红色标记的片段为两个蛋白与geph的结合位点。可进一步计算Ki，结果重复性很好，信噪比高（图3）。


图2：基于TRIC的单剂量高通量筛选，有结合的肽段用红色标记，红色区域为蛋白结合的motif


图3：Ki 结果


竞争实验设置方式

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第一步：标记小分子或者是多肽作为荧光分子，作为tracer，与蛋白进行互作实验，得到亲和力常数—Kd1

第二步：进行的是竞争性实验，实验中tracer浓度保持和第一步相同，蛋白的浓度为实验一中Kd1的1.5-2倍，将蛋白和标记的分子混合，将混合的complex作为竞争实验的荧光分子，倍比稀释待筛选的分子，进行亲和力实验得到EC50，计算出Ki


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NanoTemper 

高通量筛选和分子互作平台（DI）介绍

NanoTemper高通量筛选和分子互作平台DI系列，提供多种型号搭载不同荧光通道，检测范围广，按需选择最适合您的型号。

DI 特点

1. 适用于任何通量，最高可在24小时内完成超过8000个单点筛选

2. 溶液中完成，贴近自然条件下结合

3. 实验设置灵活，如竞争实验、三元互作实验等

4. 快速设置：整合亲和力表征的常用实验模版


5. 使用标准尺寸384孔板（右图），可与高通量自动移液平台和机械手连用


参考文献

Schulteet al., iScience 24,101898, January22, 2021 ª 2020 The Author(s), 

https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101898


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