行业巨头教你3D肿瘤球的培养及监测分析

2022-08-09 19:29:58, 陈老湿德国赛多利斯集团

不久前，陈老湿给大家介绍过“从2D到3D，Incucyte®依然看得清！”，通过建立3D细胞模型，在更贴近体内生理学特征的基础上进行药物开发和相关细胞表型分析，是目前生命科学及生物制药的研究热点。但是，如何有效追踪3D细胞球的生长过程和药物治疗引起的体积及形态变化？这是一个新的课题。

今天陈老湿就给大家介绍一个范例。美国艾伯维（Abbvie Inc.）公司药物代谢与药代动力学部门的研究人员在“Effects of microtubule-inhibiting small molecule and antibody-drug conjugate treatment on differentially-sized A431 squamous carcinoma spheroids^[1]”一文中建立A-431鳞状癌肿瘤球模型，采用抗体偶联药物（ADC）处理，监测分析其对不同大小肿瘤球的影响。

肿瘤球的形成

图1: 经Sartorius公司的慢病毒试剂转染的A431细胞可显示红色荧光，在ULA板中接种密度为0.4×10³个细胞/孔（汇合度约25%），在Incucyte®系统中连续监测，约12小时后肿瘤球形成。

肿瘤球的生长

图2: 3,200个A431细胞接种后，对肿瘤球的生长9天的跟踪，并计算肿瘤球直径，由第1天的338 μm (±5.5 μm)增长到第9天的581 μm (±42 μm)

图3: Incucyte®系统对肿瘤球的分析。A为健康肿瘤球，B为死亡肿瘤球。采用明场+红色荧光进行肿瘤球的Mask计算

将A-431细胞以不同的起始细胞数（200~12800个细胞/孔）进行接种，采用Incucyte®长时间活细胞成像系统监测肿瘤球的动态生长过程，肿瘤球直径呈现良好的线性变化趋势。不同的接种数量基本都可以在6~12小时后形成稳定的肿瘤球，168小时后，肿瘤球直径可达323μm~683μm，平均增长速度为0.45~1.43μm/小时。监测7天后，200个细胞的肿瘤球体积可达1.1 × 10⁷ μm³，而12800个细胞的肿瘤球体积可达1.4 × 10⁸ μm³。这反映了实验的可重复性和稳定性，以及少量的细胞接种数量可更有效地反映肿瘤球的变化趋势。

图4: 3,200个A431细胞接种后，对肿瘤球的生长9天的跟踪，并计算肿瘤球直径，由第1天的338 μm (±5.5 μm)增长到第9天的581 μm (±42 μm)

肿瘤球加药处理

由于A431细胞表达高水平的表皮生长因子受体(EGFR)，研究人员将靶向EGFR的单抗Ab033，通过还原半胱氨酸与Auristatin F（中文名：奥瑞他汀 F，是一种具有细胞毒性的微管蛋白抑制剂，具有强效抗肿瘤活性，是MMAF的类似物以及作为ADC药物中的毒素分子）马来酰咪唑丙基连接后形成一种ADC药物，命名为033-F。033-F具有多种机制，如抗体结合的EGFR抑制或/和药物结合的微管抑制，可以导致细胞死亡。

图5: 800个细胞接种后成球的第9天，加入不同剂量的033-F药物，持续监测随后14天的肿瘤球直径变化。1nM时对肿瘤球几乎没有作用，64nM的浓度则毒性作用显著

在肿瘤球大小一致的情况下，在高剂量的033-F的作用下，A-431肿瘤球体现出明显的敏感性，细胞死亡和直径变小，从683μm缩小为383μm。随后改变肿瘤球的大小，来研究药物作用是否会因肿瘤大小变化而受到影响。A-431细胞接种密度范围扩大为200~25600个细胞， 9天后形成8种不同肿瘤球，再用033-F处理肿瘤球14天。

图6: 8种大小的肿瘤球在不同剂量药物处理后，荧光信号、形态、面积、直径及IC₅₀比较

结果表明，33-F药物的处理效果与肿瘤球的尺寸显著相关。球体越小，药物毒性作用越明显，肿瘤球体积减小越快。球体越大，则药物作用约不明显。在处理336小时（14天）后，低剂量组对肿瘤球影响较小，而最高剂量组的体积则从初始值均可减少85%以上。平均的IC50值也从400个细胞肿瘤球的0.67 nM升高到25600个细胞肿瘤球的1.76 nM。

Summary

文章最后讨论了肿瘤球大小与药物作用之间的关系和影响，作者认为肿瘤球越大，对于药物向肿瘤内部的渗透，细胞间的相互作用，以及对治疗药物的抗性都会增加。这可能是因为大体积的肿瘤球在体积膨胀后内部可能会形成一个有机微环境，使得药物对球体内部的渗透能力是有限的。这导致2D的单层细胞与3D的肿瘤球细胞对于药物的评价结果很可能有差异的，3D细胞模型在药物评价方面显然是更好的选择。

同时，在使用3D肿瘤球模型时，往往需要通过长时间的药物处理，比如ADC药物被细胞内吞，毒素分子缓慢释放，逐渐达到治疗效果。这就需要一个有效的工具，来进行长时间地监测与分析，并且能够实时分析和处理。Abbvie的科学家采用的正是Incucyte® 长时间活细胞分析系统，直接安装在细胞培养箱内，对细胞自动连续（数天、数周或数月）拍照获取活细胞的明场和荧光图像。6个板位的设计及完整的解决方案为加速临床前的药物筛选和开发提供了令人兴奋的机会。

Incucyte® 高通量实时活细胞分析系统

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-参考文献-

[1] Durbin, K.R., Nottoli, M.S. & Jenkins, G.J. Effects of microtubule-inhibiting small molecule and antibody-drug conjugate treatment on differentially-sized A431 squamous carcinoma spheroids. Sci Rep 10, 907 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-57789-y

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