赋能科研︱DNBelab C4单细胞建库+DNBSEQ-T7测序，助力构建首个家猪多器官组织单细胞转录图谱

2022-07-30 11:07:31, 共享未来的深圳华大智造科技有限公司

2022年7月12日，由深圳华大生命科学研究院Lars研究所罗永伦教授和丹麦奥胡斯大学林琳教授联合国内外多个研究团队，于近日发表在Nature Communications（影响因子17.694）的首个家猪组织器官单细胞转录图谱论文“Endothelial cell heterogeneity and microglia regulons revealed by a pig cell landscape at single-cell level”作为Editors’ Highlights入选《自然通讯》杂志 “From molecules and cells to organisms” 专题。

图1《自然通讯》近期50佳亮点论文部分截图

该研究中使用了华大智造自主开发的高通量单细胞RNA文库制备试剂盒（DNBelab C4）和DNBSEQ-T7测序平台，助力首次构建了家猪多个组织和器官的单细胞转录组图谱，并揭示了血管内皮细胞在组织器官内的功能异质性和大脑小胶质细胞遗传保留转录调控网络，对促进模式猪在异种器官移植和生物医药领域的应用提供关键科研资源和科学基础。

研究背景

家猪（Sus scrofa domesticus）是生物医药研究、新药开发、研究人类复杂疾病机理的的关键模式大动物之一。同小型模式动物相比，猪大脑结构与人类更加接近，因此也是被认为研究人类大脑和退行性神经疾病的重要大动物模型。由于猪器官在大小、结构、生理功能、和遗传学等方面都与人类器官非常接近，也是被公认为解决器官紧缺医学问题的最佳异种器官移植供体[1,2]。通过基因编辑和克隆技术，疾病模型猪已经被成功应用于杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy）、亨廷顿病（Huntington’s disease）、糖尿病（Diabetes）等[3-5]。

今年初，首例将基因编辑猪的心脏成功移植到绝症患者体内试验也在美国马里兰大学医学院成功进行。但是，由于目前缺乏对猪组织器官细胞异质性和基因表达调控的了解，疾病模型猪的表型和异种器官移植的临床表现依然有待改进[6, 7]。因此，深入认识并阐明家猪组织器官细胞异质性和基因表达调控机制是促进模式猪在生物医药领域的应用和异种器官移植的重要手段。

技术路线

图2 研究技术路线

研究亮点：家猪多器官组织单细胞转录组图谱

目前，多个模式动物的单细胞转录图谱陆续被完成，为填补了家猪在这一研究领域的空白，研究使用DNBelab C4单细胞核转录组（snRNA-seq）建库、单细胞转录组（scRNA-seq）建库及DNBSEQ-T7进行测序，获得了20个组织器官中222,526个细胞的高质量单细胞/细胞核转录组数据（图3a-d）。结合单细胞转录组聚类分析，降维可视化（tSNE），和基因功能富集分析，共鉴定了234种表达特异性细胞聚类和58种细胞类型（图3e-f），并进一步构建了可视化家猪单细胞转录组数据库（Pig Single Cell Atlas Database）[8]。

图3 家猪单细胞转录组图谱

（图源：WangF,et al., Nat Commun, 2022）

研究亮点：TGF-β2信号通路在EndMT转分化中起关键作用

此外，研究结合前期对小鼠和人内皮细胞异质性研究的基础[9-10]，通过细胞类型特异性表达基因筛选方法，对脂肪内皮细胞进行了更加深入的研究，并通过拟时序分析（pseudotime analysis），免疫荧光染色，和定向诱导分化实验发现和验证了依赖于TGF-b2信号通路的内皮间质转分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）细胞类型（图4d-f）。这些数据表明：在家猪组织和器官中，内皮细胞也存在着高度的功能异质性，为进一步利用模式猪研究人类心血管疾病和改善异种器官移植免疫排斥反应提供关键基础数据。

图4 猪组织中内皮细胞的单细胞转录组分析

（图源：WangF,et al., Nat Commun, 2022）

研究亮点：跨物种小胶质细胞单细胞转录组数据对比

除此之外，作者还通过小胶质细胞作为研究对象，对家猪、人、小鼠、蜥蜴等13个物种的大脑小胶质细胞单细胞转录组数据，利用基因调控网络推断（GENIE3）方法系统研究小胶质细胞在进化过程中的转录因子调控网络（图5a-e）。作者发现MEF2C等核心转录因子以及其调控基因在小胶质细胞的演化中具有保守性（图5f-g）。虽然该研究没有对这些核心转录调控网络的作用机制和其它大脑细胞类型进一步深入研究，但是，针对小胶质细胞转录调控网络分析表明：MEF2C转录调控可能小胶质细胞分子遗传进化过程中起到非常关键的作用。

图5基于单细胞转录分析大脑小胶质细胞在进化过程中的保守性转录调控网络

（图源：WangF,et al., Nat Commun, 2022）

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31388-z

深圳华大生命科学研究院Lars研究所和奥胡斯大学王飞博士、中国科学院大学硕士研究生丁佩文、青欧与哥本哈根大学联合培养博士生梁雪、奥胡斯大学博士生丁香凝，和奥胡斯大学博士生Camilla B. Brandt为该论文共同第一作者。

高通量测序平台助力单细胞组学

进入规模化研究时代

随着单细胞测序技术的发展，单细胞组学研究也已经进入了超高通量、超大规模的研究阶段。华大智造自主可控的国产化单细胞建库平台DNBelab C4搭配DNBSEQ-T7高通量测序平台打破了单细胞研究门槛高的瓶颈，提供了稳定、经济、便携的一站式产品组合（图6）。

图6 DNBelab C4+DNBSEQ-T7助力规模化单细胞组学研究

DNBelab C4单细胞平台已发表文章列表：

年份	期刊	文章标题	影响因子
2022/3/22	Nature	Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage	49.962
2022/4/13	Nature	Cell transcriptomic atlas of the adult non-human primate Macaca fascicularis	49.962
2020/9/15	Immunity	Single-Cell Sequencing of Peripheral Mononuclear Cells Reveals Distinct Immune Response Landscapes of COVID-19 and Influenza Patients	31.745
2022/6/24	Nature Communications	Endothelial cell heterogeneity and microglia regulons revealed by a pig cell landscape at single-cell level	17.694
2022/6/16	Nature Ecology & Evolution Nature	A single-cell transcriptomic atlas tracking the neural basis of division of labor in an ant superorganism	15.460
2022/5/4	Developmental Cell	Spatiotemporal mapping of gene expression landscapes and developmental trajectories during zebrafish embryogenesis	12.270
2021/3/5	Theranostics	Single-cell transcriptome analysis of the heterogeneous effects of differential expression of tumor PD-L1 on responding TCR-T cells	11.556
2020/12/31	Clinical and Translational Medicine	Multiregion single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of the immune microenvironment of colorectal cancer	11.492
2022/1/29	Clinical and Translational Medicine	Molecular mechanisms governing circulating immune cell heterogeneity across different species revealed by single-cell sequencing	11.492
2022/5/6	Clinical and Translational Medicine	Single-cell atlas of peripheral blood mononuclear cells from pregnant women	11.492
2021/12/1	Anal. Chem.	High-Throughput Functional Screening of Antigen-Specific T Cells Based on Droplet Microfluidics at a Single-Cell Level	6.986
2022/5/23	Anal. Chem.	Generation and Screening of Antigen-Specific Nanobodies from Mammalian Cells Expressing the BCR Repertoire Library Using Droplet-Based Microfluidics	6.986
2022/1/22	Journal of Inflammation Research	Single Nuclear RNA Sequencing Highlights Intra-Tumoral Heterogeneity and Tumor Microenvironment Complexity in Testicular Embryonic Rhabdomyosarcoma	6.922
2022/3/1	Front. Cell Dev. Biol.	Single-Cell Atlas of the Chinese Tongue Sole (Cynoglossus semilaevis) Ovary Reveals Transcriptional Programs of Oogenesis in Fish	6.684
2022/4/6	Front. Cell Dev. Biol.	Transcriptomic profile of the mouse postnatal liver development by single nucleus RNA sequencing	6.684
2022/6/14	Scientific Data	A map of bat virus receptors derived from single-cell multiomics	6.444
2022/3/18	iScience	Single-cell multiomics reveals heterogeneous cell states linked to metastatic potential in liver cancer cell lines	5.458
2021/5/20	Journal of Genetics and Genomics	A high-resolution cell atlas of the domestic pig lung and an online platform for exploring lung single-cell data	4.275
2021/4/2	Biochemical and Biophysical Research Communications	Single-cell transcriptional diversity of neonatal umbilical cord blood immune cells reveals neonatal immune tolerance	3.575
2022/1/21	Cell Insight	Single-cell transcriptomic landscape identifies the expansion of peripheral blood monocytes as an indicator of HIV-1-TB co-infection	--

参考文献

[1] Wolf, E., Kemter, E., Klymiuk, N. & Reichart, B. Genetically modified pigs as donors of cells, tissues, and organs for xenotransplantation. Anim. Front. 9, 13-20 (2019).

[2] Sykes, M. & Sachs, D.H. Transplanting organs from pigs to humans. Sci. Immunol. 4, eaau6298 (2019).

[3] Klymiuk N, Blutke A, Graf A, Krause S, Burkhardt K, Wuensch A, et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Human Mol Genet. 2013;22:4368-82.

[4] Yan, S. et al. A huntingtin knockin pig model recapitulates features of selective neurodegeneration in Huntington’s disease. Cell 173, 989-1002 e1013 (2018).

[5] Kleinwort, K. J. H. et al. Retinopathy with central oedema in an INS (C94Y) transgenic pig model of long-term diabetes. Diabetologia 60, 1541-1549 (2017).

[6] Montgomery RA, Stern JM, Lonze BE, et al. Results of Two Cases of Pig-to-Human Kidney Xenotransplantation. N Engl J Med. 2022;386(20):1889-1898. doi:10.1056/NEJMoa2120238.

[7] Griffith BP, Goerlich CE, Singh AK, et al. Genetically Modified Porcine-to-Human Cardiac Xenotransplantation [published online ahead of print, 2022 Jun 22]. N Engl J Med. 2022;10.1056/NEJMoa2201422. doi:10.1056/NEJMoa2201422.

[8] Pig Single Cell Atlas Database. URL:https://dreamapp.biomed.au.dk/pigatlas/

[9] Kalucka J, de Rooij LPMH, Goveia J, et al. Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells. Cell. 2020;180(4):764-779.e20. doi:10.1016/j.cell.2020.01.015.

[10] Goveia J, Rohlenova K, Taverna F, et al. An Integrated Gene Expression Landscape Profiling Approach to Identify Lung Tumor Endothelial Cell Heterogeneity and Angiogenic Candidates [published correction appears in Cancer Cell. 2020 Mar 16;37(3):421]. Cancer Cell. 2020;37(1):21-36.e13. doi:10.1016/j.ccell.2019.12.001.