空间组图谱成像分析预测实体肿瘤生物标志物，赋能细胞治疗

世界卫生组织(WHO)发布的最新《2020年世界癌症报告》，对中国癌症情况进行了全面的分析。中国作为世界上人口最多的国家，癌症人口数占新增癌症病例的23％以上，其中约50%的新病例来自肝癌、食管癌和胃癌。死亡人数约占全球的30％, 高居全球第一[1]。

2022年2月27日，中国国家癌症中心发布最新的中国癌症报告：《2016年中国癌症发病率和死亡率》，根据报告显示中国前十的癌症分别是，肺癌，肝癌，胃癌，食管癌，结直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，神经系统癌症，白血病以及宫颈癌。十种癌症占癌症死亡总数达到83%，仅白血病一项是血液肿瘤[2]。2021年可谓中国细胞治疗的元年，多款细胞治疗商品几乎同时上市，让患者见到了一丝曙光，但仔细看来，主要针对血液肿瘤。

以CAR T为基础的细胞治疗产品在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了显著的成功，但在实体瘤方面尚未取得突破性的进展。除了组织微环境带来的阻碍和T细胞浸润的固有障碍外，还缺乏适合CAR T治疗的细胞表面靶分子，如肿瘤细胞覆盖率高，靶向/非肿瘤毒性低。目前，许多细胞表面标记物正在研究用于实体瘤CAR T细胞治疗。同时，也有结合不同标记物以规避肿瘤逃逸机制或降低非肿瘤毒性的策略[3]。

MACSima全自动空间组图谱成像分析系统，具有最温和的信号擦除机制，可以在单个样本上同时实现数百个标记物的检测，同时基于一种新的图像处理系统，可有效去除图像中的伪影，可以实现亚细胞水平对细胞蛋白质的高灵敏度检测（图1）。

图1：MACSima全自动空间组图谱成像分析系统。（a）MACSima系统具有全自动液体处理和图像采集功能。（b）利用光漂白擦除和荧光染料解离实现擦除，用REAdye_lease™和REAlease®荧光染料偶联抗体的复合物进行染色的样本，可通过控制荧光染料的解离实现快速且温和的信号擦除。（c）循环成像。（d）使用MACS iQ View软件进行图像分析，该软件包括原始图像中的细胞分割、聚类。

通过多标记分析方法确定实体瘤免疫治疗的潜在靶点，成为实体瘤治疗的重要环节。本文利用MICS技术对胰腺导管腺癌（PDAC）进行筛查，揭示了CD318, TSPAN8和CD66c可作为胰腺导管腺癌CAR T细胞治疗的潜在靶点[4]。

基于CAR T免疫治疗的PDAC细胞表面候选靶点的筛选

在现有的肿瘤免疫学分析方法中，无论是单细胞转录组数据，还是蛋白表达谱空间分布信息，这些方法在组织处理过程中都伴有信息丢失。因此原位图像数据采集便体现了前所未有的优势。研究人员通过基于371单克隆抗体panel的流式细胞术筛选确定PDAC-PDX模型细胞表面表达的前50个抗原，采用了MICS自动循环荧光成像的方法，对两个PDAC肿瘤样本分别进行了107和98个标记物表达和定位分析，结合生物信息分析结果，对所测标记物的“前景度”进行评分，评分最高的4个标记物为：CLA, TSPAN8.CD318和CD66c（图2）。

图2：PDAC细胞表面候选靶点的筛选流程

构建CAR表达载体，验证特异性靶点

针对识别出的CLA, CD66c, CD318, and TSPAN8四个标记物后，我们设计了一个具有不同spacer长度（XS、S、M和L）和scFv（Vh-Vl和Vl-Vh）的CAR Library（图3a）。显示这些要素对CAR的功能至关重要。所有CAR均采用第二代设计，CD3ζ和4-1BB为刺激结构域，CD8α跨膜结构域。经过一系列验证得出CLA特异性CAR功能失调，而CD66c、CD318和TSPAN8特异性CAR在体外诱导有效激活、细胞因子释放和抗肿瘤疗效。

图3：特异性靶点验证

候选靶点的体内肿瘤杀伤验证

将Luc+AsPC1细胞移植到NSG小鼠体内，生物荧光信号显示为肿瘤组织，通过观察肿瘤生长动力学情况，来评估肿瘤杀伤情况。结果显示，当小鼠肿瘤体积达到25mm2时，静脉注射CAR-T，与对照组相比，CD318-CAR-T细胞具有显著快速的肿瘤清除效果，TSPAN8-CAR-T细胞也具有杀伤肿瘤的作用，作用较弱，但三个月内也实现了肿瘤清除。CD66c S V1 -Vh CAR与其他相比，表现欠佳（图4）。

图4：候选靶点的体内肿瘤杀伤验证实验

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参考文献：

[1] World Cancer Report: Cancer Research for Cancer Prevention.

[2] Cancer incidence and mortality in China, 2016

[3] Kinkhabwala A , Herbel C , Pankratz J , et al. MACSima Imaging Cyclic Staining (MICS) Technology Reveals Combinatorial Target Pairs for CAR T Treatment of Solid Tumors. 2021.

[4] Schfer D , Tomiuk S , Laura N. Küster, et al. Identification of CD318, TSPAN8 and CD66c as target candidates for CAR T cell based immunotherapy of pancreatic adenocarcinoma[J]. Nature Communications.