抗体验证——拯救“重现性危机”

美天旎如何解决对重现性和抗体验证的需求？

REAfinity抗体源于一段只编码一种重链和轻链的DNA序列，从而确保抗体的高纯度。

对纯化得到的REAfinity抗体进行质谱分析，数据表明：REAfinity抗体纯度非常高，而杂交瘤来源的抗体是一种混合物。

A. 对两个杂交瘤来源的单克隆抗体样本进行质谱分析，可以看出，它们都含有一条分子量接近23,635 Da的污染轻链。B. 两个REAfinity重组抗体样本的质谱分析结果显示，其含有极高纯度的轻链。

此外，在抗体原料生产以及荧光色素结合过程中，对所有抗体进行了批次间一致性测试。

这包括从混合物中除去未结合的荧光染料和抗体的纯化步骤，以及与先前批次的并排比较。

不同批次的REAfinity抗体染色结果几乎一致。用两个批次的5个CD56 REAfinity类抗体，对同一供者来源的PBMC进行染色，然后用MACSQuant 流式细胞仪检测。直方图中的两条曲线（黑色和红色）代表了两个不同批号的抗体，数据显示，不同批次的REAfinity 抗体的染色结果几乎一致，从而证明其批次间稳定性极高。

为了验证REAfinity抗体与其靶抗原结合的特异性，我们引入了以下几种方法来验证抗体。

为了比较抗体的表位特异性，将细胞与过量的未标记荧光的REAfinity抗体孵育，然后用其他已知克隆的抗同一标记物的荧光标记的抗体染色。基于获得的荧光信号，将克隆分为三类，表位完全重叠（++）、部分重叠（+）或完全不同的表位（-），下表中列出了REAfinity克隆CD56（REA196）的测定结果。

在合适的细胞系中，用位点特异性核酸酶敲除靶基因，并对靶基因座进行测序以确认敲除。

用荧光显微镜以及流式细胞术分析样本，如果无法检测到与敲除细胞结合的抗体，则表明该抗体与预期的表位特异性结合。

CD53敲除细胞的荧光显微镜图像。 野生型（WT，左）和敲除细胞（KO；右）用CD53-PE（REA259，红色）染色，并用DRAQ5（蓝色）作为DNA染色剂。

CD53敲除细胞的流式细胞分析。 排除重复和死细胞后，用CD53-APC（REA259）对野生型（红色）和基因敲除细胞（蓝色）进行染色，并使用MACSQuant Analyzer 10通过流式细胞仪进行分析。

使用RNA干扰（RNAi）敲低靶抗原。用非编码RNA寡核苷酸转染细胞，来抑制靶RNA的翻译。

转染的细胞与未转染对照细胞之间的对比，表明了被测抗体对其抗原的特异性。

RNAi敲低靶抗原。左峰表示用AKT1 RNAi转染的HeLa细胞，右峰是未转染的对照。将细胞固定、透性化，并用抗AKT1抗体-荧光染料结合物进行染色。使用MACSQuant Analyzer 10进行流式细胞术分析。

抗体的敏感性，对于能够可靠地鉴定靶细胞至关重要。我们采用以下方法来确保抗体的敏感性。

所有荧光标记的抗体，包括同一克隆的多个荧光标记物，都会在实际样品上进行测试，并尽可能在多色通道中测试抗体。

另外，对源自组织的细胞，常规地使用酶处理，这样能够验证抗体对经过酶促处理的表位的敏感性。

我们通常将美天旎的偶联抗体与其他供应商的偶联抗体的性能进行比较，以确保在流式细胞仪应用中具有更好或至少相似的性能。

每批产品均通过一系列滴度梯度验证，以确保产品在滴度范围内的有效性。

REAfinity重组抗体具有高染色指数。用来源于杂交瘤细胞和REAfinity克隆REA196的CD56抗体，对人PBMC进行染色。使用了抗体供应商的推荐滴度。

克隆REA196的对比数据。用REAfinity克隆REA196的CD56抗体和其他品牌的CD56抗体，对人PBMC进行染色，并用MACSQuant Analyzer 10进行分析。

我们的抗体在固定过程中也经过了稳定性测试。该测试验证了细胞固定后仍然可以检测到抗原的表位。固定试剂的兼容性信息可在说明书中找到。