CTM | 南京医科大学第一附属医院杨涛教授团队蛋白组/磷酸化修饰组揭示神经调节胰岛激素分泌关键激酶分子

约稿 | 南京医科大学第一附属医院 何云强

胰岛内具有丰富的神经网络分布，大脑通过多种神经纤维和递质对胰岛功能发挥重要支配作用，其中交感和副交感神经通过神经递质在胰岛结构发育与激素分泌过程中具有重要意义。去甲肾上腺素 (NE) 和乙酰胆碱 (ACh) 分别作为这两种神经重要的递质之一，也是大脑中枢传出神经 (去甲肾上腺素能神经和胆碱能神经) 的主要递质，两者相互拮抗并在不同生理状态下对胰岛功能维持和稳定发挥快速调节作用。近几年来，关于这两种相互拮抗的神经递质对胰岛不同内分泌细胞的具体作用机制仍不完全清楚，且神经调控障碍是否参与糖尿病发生发展也尚不明确。

2022年06月27日，江苏省人民医院 (南京医科大学第一附属医院) 内分泌科何云强/杨涛团队在国际期刊Clinical and Translational Medicine在线发表了题为“Phosphoproteome reveals molecular mechanisms of aberrant rhythm in neurotransmitter-mediated islet hormone secretion in diabetic mice” 的最新研究成果，揭示了交感/副交感神经在胰岛激素分泌过程调节中的关键激酶和靶点，且在糖尿病状态下，胰岛内交感/副交感神经递质调控作用存在显著障碍，并且通过干预关键受体和激酶活性可改善神经递质刺激下胰岛素快速分泌功能节律紊乱。景杰生物为该研究提供了组学数据挖掘与磷酸化特异性位点抗体定制服务。

研究通过对交感/副交感神经递质NE和ACh的特异性标志物在小鼠胰岛α/β/δ等内分泌细胞上的表达分布进行了鉴定，并通过胰岛灌流观察两种递质对insulin/glucagon/somatostatin三种激素分泌的快速调控作用，并进一步利用定量蛋白组学和磷酸化修饰蛋白组学分别筛选神经递质ACh和NE在胰岛激素分泌过程中的关键通路和分子靶点。

图1 实验流程图解

利用定量蛋白组学共鉴定到小鼠胰岛蛋白5021个及肽段37075个，神经递质ACh/NE刺激前后，胰岛蛋白表达水平未见明显变化 (差异蛋白比例分别为1‰和3‰)，而磷酸化修饰水平出现显著差异 (其中发生磷酸化修饰改变的蛋白质3791个，磷酸化位点15377个及磷酸化肽段10593个)。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸所占比例分别为81.71%、16.62%和1.66%；磷酸化修饰PCA成分图也存在显著区分。ACh处理组磷酸化上调的蛋白187个，下调的蛋白265个，而NE处理组磷酸化上调蛋白309个，下调蛋白622个；磷酸化修饰差异显著的蛋白分别参与突触信号传导、钙离子通道开放、激素分泌等多种生理和病理学过程；其中胰岛内MAPK、ERK1/2及PKC等多种激酶对蛋白磷酸化过程具有重要调控作用。进一步利用Motif分析预测到神经递质ACh和NE介导的胰岛多种激素分泌的关键激酶共23种，进一步通过RT-PCR验证后，结果表明23种激酶在正常小鼠胰岛内均具有高表达，通过特异性siRNA对关键激酶表达干预后进行递质刺激及分泌功能实验，筛选出两种神经递质的关键调控激酶KSR2 (ACh) 和PKACB (NE)。

图2 定量蛋白组筛选关键蛋白

进一步构建及利用多种胰岛功能不同的糖尿病小鼠病理模型 (STZ、NOD、HFD、ob/ob小鼠及db/db小鼠等)，分别观察在1型/2型糖尿病病理模型小鼠胰岛中，交感和副交感两种神经递质的快速调节作用是否出现障碍。研究分别从神经递质(ACh/NE)、受体(M3受体/α2a受体)、激酶(KSR2/PKACB)及分子底物(Cadps/Sik2/Mlxipl/Pdcd4) 等不同水平进行研究。结果表明，胰岛功能障碍早期的糖尿病小鼠 (HFD小鼠) 胰岛内ACh及NE关键激酶 (KSR2/PKACB) 和底物表达水平未出现显著下降，但递质刺激后关键激酶介导的底物蛋白磷酸化修饰过程出现异常(Cadps/Mlxipl/Pdcd4)，该快速修饰过程异常导致胰岛细胞对神经信号的快速反应“失敏”。

图3 神经递质对胰岛激素分泌的异常调节与不同糖尿病小鼠的胰岛功能障碍密切相关

而进一步通过对糖尿病小鼠胰岛内激酶活性进行测定，结果提示糖尿病小鼠胰岛内激酶KSR2活性下降 (介导磷酸化修饰)，而PKACB活性异常激活 (介导去磷酸化修饰)，因此分别对关键受体 (M3/α2a受体) 和激酶活性进行特异性干预，结果表明神经递质ACh和NE介导的胰岛素快速分泌节律可出现显著改善。而在1型糖尿病小鼠及胰岛功能衰竭的2型糖尿病小鼠 (db/db 小鼠) 中，神经递质受体及激酶和底物表达均出现显著下降，且干预后递质介导的快速分泌作用与节律紊乱无改善作用不明显。

图4 对不同糖尿病小鼠受体和关键激酶的联合干预

综上所述，该研究利用蛋白组+磷酸化修饰组学定量技术筛选出两种神经递质的关键调控激酶KSR2 (ACh) 和PKACB(NE)，同时揭示了异常神经支配与糖尿病小鼠胰岛功能障碍的程度密切相关，糖尿病早期关键受体和激酶干预后，胰岛素分泌的异常节律可得到显著改善的机制。该研究说明了胰岛内神经调控功能异常的早期干预对胰岛功能的改善具有重要意义，这可能成为将来临床糖尿病治疗的重要靶点之一，可能为未来糖尿病提供有希望的治疗策略。

图5 交感神经和副交感神经递质 (NE/ACh) 通过胰岛细胞中关键受体和激酶调节胰岛素快速分泌图解

本文为江苏省人民医院 (南京医科大学第一附属医院) 何云强博士/付麒博士/孙敏主任为本文共同第一作者，徐宽枫研究员/杨涛教授为本文共同通讯作者，上述研究工作得到了国家自然科学基金重点项目、面上项目及青年项目基金支持。

Nat Comm | 上科大水雯箐/何旭明团队开发深度神经网络模型挖掘磷酸化蛋白质组数据

2021-11-25

STTT | 刘芝华/崔永萍合作团队磷酸化修饰组学揭示食管癌发生新机制及治疗新靶点

2021-11-17

CTM | 清华大学深圳国际研究生院张雅鸥教授团队巴豆酰化/乙酰化修饰研究揭示Ⅱ型糖尿病抑制新靶点

2022-03-08

洞悉入微，CELL METAB | 磷酸化组学揭示糖尿病的关键致病信号节点

2019-06-24

Cell Reports：多维组学揭示年龄改变影响胰岛β细胞代谢重编程的机制

2018-12-12