JEV | 上海交通大学陈万涛/严明发现小细胞外囊泡介导肿瘤进展及免疫逃逸分子机制

肿瘤微环境（TME）影响患者对免疫治疗的响应度。携带大量生物活性分子的细胞外囊泡（EVs）可以在细胞间传递信号并重塑 TME。因此，在制定抗肿瘤治疗策略时，应综合考虑 EVs、TME 和免疫细胞之间复杂的相互作用。

近日，上海交通大学医学院附属第九人民医院陈万涛/严明团队，在 Journal of Extracellular Vesicles (IF: 25.841) 期刊在线发表了题为 “CD73 in small extracellular vesicles derived from HNSCC defines tumour-associated immunosuppression mediated by macrophages in the microenvironment” 的研究论文，研究表明头颈鳞癌细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）运载的 CD73 可以重塑 TME 并促进肿瘤进展、介导免疫逃逸。

从原代培养的头颈鳞癌（HNSCC）细胞及配对正常黏膜细胞上清中分离 sEVs。蛋白组学分析显示，与正常黏膜细胞相比，HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73（图 f-h）。

CD73 是由 NT5E 基因所编码的一种膜结合形式的外核苷酸。TCGA 数据分析表明，NT5E 基因在包括 HNSCC 在内的多种肿瘤中高表达，并且与 HNSCC 患者较低的总体生存率密切相关。免疫组化结果显示，CD73 在 HNSCC 肿瘤组织中高表达，并且与患者不良预后和高淋巴结转移率相关。

免疫浸润分析表明，NT5E 表达与巨噬细胞密切相关（图 c），免疫荧光结果也表明 CD73 与巨噬细胞共定位（图 d-e）。

进一步分析显示，高 NT5E 表达、高巨噬细胞浸润的 HNSCC 患者总体生存率最低（图 f）。

小鼠移植瘤注射 sEVs^CD73，结果显示 sEVs^CD73 主要与巨噬细胞共定位（图 h-i），表明 sEVs^CD73 被巨噬细胞吞噬。同时体内实验结果表明（图 j-n），肿瘤细胞来源的 sEVs 可以重塑引流淋巴结微环境，形成利于肿瘤转移的转移前微环境，sEVs 携带的 CD73在这一过程中发挥重要作用。

与对照相比，与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞中 CD73 表达水平上升（图 b）；而与 RAB27A 敲除以抑制 sEVs 释放的细胞共培养的巨噬细胞相比，其 CD73 含量与正常对照组相当（图 b），表明 CD73 主要通过 sEVs 运输。

sEVs 中 CD73 的水平会影响 CD73⁺ 巨噬细胞的比例，使其随着共培养体系中 sEVs^CD73 的累积而增加。当 sEVs^CD73 被巨噬细胞内化后，其吞噬作用明显增强（图 c），同时分泌促癌炎性细胞因子 IL6、IL10、TNFα、TGFβ 能力显著增加（图 e-f），预示 CD73⁺ 巨噬细胞具有更强的促瘤作用。流式分析显示（图 h），sEVs^CD73 使巨噬细胞免疫检查点（PD-1，PD-L1，LAG3等）表达上调，表明 CD73⁺ 巨噬细胞可发挥更强的免疫抑制能力。

接下来评估 sEVs^CD73在介导体内免疫抑制和肿瘤进展中的作用。

与对照组相比，Rab27a 敲除组（SCC7Rab27aKO）的小鼠肿瘤生长速度慢、肿瘤偏小，表明 sEVs 可促进肿瘤进展。

然而，注射外源性中高表达的 CD73 的 sEVs（sEVsSCC7-Nt5eOE 和 sEVsSCC7）则会显著促进肿瘤的发展，但 NT5E 敲除的 sEVsSCC7-^NT5EKO并没有此作用（图 b-d）。结果表明 sEVs^CD73 在 HNSCC 的进展中具有重要的作用。

同时，流式分析显示，sEVs^CD73 可招募巨噬细胞、Tregs 细胞，而 CD8⁺ T 细胞浸润数目减少。此外，在瘤内注射了含 CD73 的 sEVs 后，这些免疫细胞尤其是巨噬细胞表面 CD73、PD-1 的表达水平均有所增加。

该体内实验结果提示，sEVs^CD73 可诱导免疫抑制，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。

对经过 HNSCC 源 sEVs 处理的 M2 巨噬细胞进行转录组测序。利用韦恩图分析M2+HNSCC 源 sEVs（M2+sEVs）相对于对照组 M2 上调的基因，以及 M2+CD73 敲除的 HNSCC 源 sEVs（M2+sEVs^NT5EKO）相对于 M2+sEVs 下调的基因。通过对两组差异基因取交集，筛选出了共 143 个可能受到 sEVs^CD73 调控的候选下游基因（图 a），而 NFκB1 是与这些差异表达基因最为相关的转录因子（图 b），富集分析也显示 NF-κB 通路富集最为显著（图 c）。进一步实验显示，sEVs^CD73 可以显著促进 p65 在巨噬细胞细胞核内积聚（图 f），激活NF-κB 通路，并促进下游基因转录。

从 HNSCC 患者血清中分离 sEVs，ELISA 检测显示其 CD73 含量高于健康人血清 sEVs（图 a-c）。并且高水平的循环 sEVs^CD73 可能预示着更高的淋巴结转移率和更大的肿瘤大小（图 d）。

为研究 sEVs^CD73 在抗 PD-1 治疗中的作用，通过体内实验进一步评估 sEVs^CD73 敲除联合抗 PD-1 药物对小鼠头颈鳞癌的治疗作用。当 sEVs 中 CD73 敲除时，PD-1抗体的治疗效果发生明显的改善（图 f-h）。将瘤组织取出并进行流式分析，在接受抗 PD-1 药物后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量有所下降，CD8⁺T 细胞的数目增加。同时，免疫细胞表面的 CD73 和 PD-1 表达下降，说明免疫抑制的现象有所缓解。这一现象在 RAB27aKO+anti-PD-1 组最为显著，说明抑制肿瘤细胞的 sEVs 释放会提高抗 PD-1 逆转免疫抑制的效率。然而在加入外源性的 sEVs^CD73 后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量明显上升，CD8⁺T 细胞的数目减少。此外，免疫细胞表面的 CD73和 PD-1 表达上升，表明 sEVs ^CD73 显著抑制了抗 PD-1 药物对免疫应答的重激活作用。

以上结果表明，肿瘤细胞源 sEVs 携带 CD73 通过 TAM 介导免疫抑制并减弱抗 PD-1 的治疗效果。sEVs^CD73 可用于预测 HNSCC 的转移，是潜在的 HNSCC 抗 PD-1 治疗的联合免疫治疗靶点。

上海交通大学医学院附属第九人民医院鲁婷玮、张瑱为论文的共同第一作者，文章中转录组测序由欧易生物完成。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/jev2.12218

1、J. Transl. Med. | 单细胞转录组助力探究顺铂耐药相关的多组学差异及机器学习模型的建立

2、项目文章 | 欧易空间转录组测序助力解析青春期大鼠弓状核的空间基因表达特征

3、项目文章 | Plant J:孙旭武课题组利用单细胞转录组解析拟南芥早期细胞转录图谱

4、项目文章 | 欧易生物单细胞转录组助力揭示心肌梗死后心脏免疫的动态变化

END

排版人：小久

原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。