项目文章 | 欧易单细胞测序助力解析玉米根尖单细胞图谱，鉴定细胞类型特异性硝酸盐响应基因

欧易生物在植物领域助力用户发表的第5篇单细胞文章来啦！

2022年2月22日，广东省科学院南繁种业研究所齐永文教授团队在The Crop Journal（IF 4.407）发表关于单细胞图谱解析玉米根尖的相关报道，该篇文章中，李旭辉老师为该篇文章的第一作者，欧易生物提供了该篇文章的单细胞转录组测序工作。下面我们一起学习这篇文章的具体内容。

根系是玉米生长和产量的基础。初生根由维管柱和皮层两部分组成，维管柱又由负责运输水和营养的木质部导管以及负责运输光合产物和其他有机物的初生韧皮部组成，帮助植物吸收养分。

除了玉米自身根系的解剖特点，玉米产量的增加在很大程度上与氮肥的使用有关。然而，作物根系吸收氮的效率相对较低，这提示我们调控根系发育是提高产量和肥料利用效率的有效策略。

因此，该篇文章旨在通过单细胞测序解析玉米根尖细胞组成图谱以及响应硝酸盐信号的特异性细胞类型，有助于研究人员精细调控根系结构和限制条件下的营养物质吸收。

作者对生长在含硝酸盐（硝酸盐+）和不含硝酸盐（硝酸盐-）培养基上的玉米幼苗根尖进行了单细胞测序，测序结果鉴定出大部分细胞类型。为了表征单细胞水平上玉米根对硝酸盐的反应，作者按照分组硝酸盐+和硝酸盐-，比较了每种细胞类型的基因表达，发现85种细胞类型特异性的硝酸盐响应基因。

作者还针对皮层、维管柱、根毛以及表皮细胞进行拟时序分析，探讨细胞发育轨迹中相关基因的表达模式的改变。此外，通过对玉米和水稻单细胞转录组的种间比较，揭示了玉米和水稻根系细胞类型多样性和保守性。

作者针对玉米幼苗主根的20个根尖 (底部2cm) 进行单细胞转录组测序 (图1A），硝酸盐+组和硝酸盐-组各自得到3790和3426个根部细胞进行后续分析。为了评估scRNA-seq的稳健性和使用原生质体进行测序的效果，作者同时对根尖进行了bulk RNA-seq，并对scRNA-seq和bulk RNA-seq结果进行相关性分析，发现两个测序结果之间具有很强的相关性 (硝酸盐+组和硝酸盐-组的Pearson相关系数分别为0.8529和0.8500) （图1B, C）。作者接下来整合两个scRNA-seq表达矩阵，进行细胞类型鉴定以及进一步数据分析（图1D, 图 2）。

数据整合后分为11个cluster，作者使用了三种策略对细胞类型进行注释：

（1) 参考文献中报道已知的标记基因，例如cluster 10，特异性表达根冠marker ZmRCP1, ZmRCP2, ZmGRP4, ZmGRP6, Zm109和phyA2（图1F）；

（2) 计算单细胞数据中每个cluster与手工或激光捕获显微解剖分离的根细胞的bulk RNA-seq表达数据之间的Pearson相关系数，cluster 8和10利用此种方法注释为维管束鞘和根毛细胞（图1G）；

（3) 对已知标记基因较少和组织特异性RNA-seq表达数据较少的cluster进行FISH检测，选择Seurat FindMarkers功能鉴定出的9个cluster特异性基因用于FISH，其中，Zm00001d049916在维管柱中显著表达，Zm00001d041611在表皮中显著表达。

综上所述，共鉴定出11种细胞数量差异较大的主要细胞类型或组织，代表了玉米根尖的主要细胞类型，反映了玉米根尖的高度异质性。

图1 | 玉米根尖细胞的单细胞测序和细胞类型鉴定

图2 | 玉米根尖各细胞标记基因的根尖结构和GO功能示意图

为了在单细胞水平上表征玉米根系对硝酸盐的响应，研究人员对生长在硝酸盐+组和硝酸盐-组的培养液中的玉米根系单细胞转录组进行了分析。分析结果显示，在两组分组中，根尖细胞类型数量和比例组成相似，除根冠细胞外，其余细胞类型在两组中的相关性较高（图3B）。为了确定细胞类型特异性基因对硝酸盐的响应，每种细胞类型的细胞根据分组处理分成两个假定的cluster，两个cluster之间的DEGs认为是细胞类型特异性的硝酸盐反应基因。共确定出85个DEGs，其中上调基因48个，下调基因37个 (图3A-left）。与bulk RNA-seq相比，从scRNA-seq中得到的63个DEGs被bulk RNA-seq鉴定为硝酸盐反应基因。通过GO富集分析，在皮质中鉴定出的39个DEGs与非生物刺激、激素和信号转导有关（图3A-right）；表皮特异性标记基因与离子转运和代谢相关。两个硝酸代谢相关基因ZmNAR2.1 (硝酸盐转运蛋白/ZM001D017095) 和ZMGS2 (谷氨酰胺合成酶2 / ZM001D026501) 在硝酸盐+组根的表皮细胞中上调（图3C–E）。在玉米根部的分生区（MZ）细胞中，硝酸盐诱导了ZmNIR1 (亚硝酸盐还原酶1 / zm001d018161) 基因的激活（图3C, F）。

图3 | 细胞类型特异性硝酸盐反应基因

根尖细胞类型在幼苗阶段呈现动态发育过程，由一群未分化的顶端分生组织细胞逐渐分化形成。作者利用monocle3对细胞进行拟时序分析（图4A），得到始于分生区 (MZ) 细胞的连续拟时序轨迹（图4B）。拟时序时间沿两条轨迹增加，皮层发育轨迹包括皮层和外皮层，而不包括内皮层；维管柱发育轨迹主要包括维管柱、原生韧皮部、伴细胞 (CC) 和维管柱鞘。

接下来，作者进一步针对拟时序轨迹中的基因表达模式进行分析。结果发现ZM00001D026163 (编码类伸展素蛋白/rgg144) 在皮质细胞中随着拟时序轨迹曲线的发展表达量逐渐上升（图4C）。为了观察表皮细胞 (根毛和表皮细胞) 的发育轨迹，作者采用slingshot算法进行分析，发现了起点相同的两个分支（图4D–F），这些细胞可以进一步分为四个亚群 （图4E）。拟时序轨迹起源于表皮细胞 (亚群1和2)，并逐渐以根毛细胞 (branch 1) 和成熟的表皮细胞 (branch 2) 两种分化的细胞类型结束（图4E）。将表皮和根毛的Marker基因映射到拟时序轨迹或者，结果显示在每种细胞类型中都有特定的表达（图4G–I）。为了进一步描述整个轨迹的基因表达模式，作者将表皮和根毛轨迹中最重要的100个基因进行聚类，并将其分为两个主要的基因簇。这两个分支的细胞表现出明显不同的基因表达模式（图4J）。虽然gene cluster1的部分基因 (底部) 倾向于在branch2中高表达，但整体表达模式并未表现出分支特异性。gene cluster2包含44个基因，这些基因优先表达在由根毛细胞组成的branch1中，并且这些基因在与生毛细胞分化和植物型细胞壁组织相关的GO中富集（图4J-right）。这些发现证实了根毛细胞由表皮细胞分化而来，反映了根表皮细胞分化过程中的转录重组，重现了根毛的发育过程。

图4 | 根尖细胞的拟时序和发育轨迹分析

为了研究玉米和水稻根系的异同，作者对玉米和水稻根系的scRNA-seq表达谱进行了比较。首先，作者从9311、Nipponbare (Nip) 和ZH11这3个已发表的水稻根scRNA-seq数据集中，根据MaizeGDB定义了一组玉米和水稻的一对一同源基因对，利用7996对同源基因对进行整合分析。然后，作者整合了水稻和玉米的scRNA-seq数据，进行降维聚类分析（图5A）。在0.6的分辨率下共分出22个cluster （图5B）。由于水稻的细胞类型已经由数据来源作者注释完成，因此作者直接将细胞类型映射到了cluster中（图5D）。根据映射结果，根毛、内皮层、韧皮部和外皮层具有较高的相似性。特别是玉米和水稻的根毛细胞表现出较高的相关性，聚成同一簇 (cluster 14)。利用根毛、内皮层和韧皮部3种保守细胞类型，鉴定了玉米和水稻中保守细胞类型的表达基因。玉米和水稻的5个scRNA-seq数据集的根毛细胞具有高度的转录相似性。对于根毛细胞，基因聚类分析显示，在两种植物的根毛中共表达了58个保守基因，GO富集分析表明，这些玉米的同源基因参与了根毛和表皮细胞的发育（图5C）。这些结果揭示了玉米和水稻同源保守基因在功能上的相似性，为发现细胞类型或组织特异性基因提供了一种新的潜在方法。

图5 | 玉米和水稻细胞类型的比较

这篇文章鉴定了玉米根尖的主要细胞类型，以及一系列细胞类型特异性的硝酸盐响应基因，为研究细胞类型分化和对硝酸盐刺激的响应提供了有价值的资源。作者进一步比较了玉米和水稻的scRNA-seq数据，发现了进化保守的细胞类型和基因。文章中所表征的基因可作为基因转移和进一步遗传分析的靶点，帮助研究人员准确控制特定细胞类型或组织中的基因表达和表型变异。

参考文献

[1] LI X, ZHANG X, GAO S, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the landscape of maize root tips and assists in identification of cell type-specific nitrate-response genes [J]. The Crop Journal, 2022, 

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单细胞事业部技术支持部 撰文

本文系欧易生物原创

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