2b-RAD | 性别特异性标记的筛选和表征利器

欧易简化基因组测序助力性别特异性标记的筛选和表征！2021年11月10日，华东农业大学农业部淡水动物育种重点实验室，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室高泽霞教授课题组利用2b-RAD技术在Aquaculture（IF:4.242）发表了基于 2b-RAD 和转录组测序的（团头鲂♀×黑尾近红鲌♂）杂交种性别特异性标记的筛选和表征的研究成果。研究中2b-RAD文库构建参考于欧易生物技术文献。

本研究中，在杂交种雌性中进行了人工诱导的雌性生殖，发现所有后代都是雌性。使用 2b-RAD 来筛选杂交物种的性别特异性标记，并通过转录组和基因表达水平的定量实验验证了一个雄性特异性分子标记。结合雌核发育种群所有雌性的结果和鉴定的雄性特异性标记，表明该杂交种是雌性同配体 (XX)，性别決定机制为XX/XY型。已鉴定的性别特异性标记对于提高杂交物种以及父本的全雄性/全雌性育种实践的效率具有重要价值。

文章标题：Screening and characterization of sex-specific markers for the hybrid(Megalobrama amblycephala♀× Ancherythroculter nigrocauda♂) based on 2b-RAD and transcriptome sequencing

研究对象：团头鲂×黑尾近红鲌 杂交种

发表期刊：Aquacultur

合作单位：华中农业大学；武汉市水产技术推广指导中心；武汉先锋水产科技有限公司

涉及欧易生物技术：2b-RAD

研究背景 

性别决定可以是雄性异配子（XY）、雌性异配子（ZW）、配子体性染色体、染色体缺失（ZZ/ZO）或常染色体型染色体类型。特别是鱼类，其性别决定系统更为复杂多变，受到遗传或环境因素的影响。了解性别决定机制的遗传基础对于提高养殖鱼类的生产力具有重要意义。性别特异性标记对于研究性别决定机制、识别性别决定基因和揭示性别差异相关的遗传结构至关重要。开发性别特异性标记并将其应用于鱼类养殖实践具有重要的生产意义和理论意义。

研究结果 

1.雌核杂交种群体和表型性别鉴定

经过PCR和Sanger测序验证，所有的鲤鱼科对照组在相应产物位置均被成功扩增。然而在雌性个体中未发现父系基因型。可见该群体中的个体可以被鉴定为雌核发育个体。 

图1.雌核发育杂种群体的群体验证。1-7代表父系个体；8-17代表雌核发育个体

共有40个性腺组织，包括20个来自杂交正常生殖的个体和20个雌核发育个体，通过石蜡包埋和H&E染色观察，结果表明，雌核发育个体均为雌性，而杂交群体正常繁殖的前体细胞为雌性或雄性，其比例约为1:1。这一结果表明，该杂交物种是具有性别決定因素的雌性同配子(XX），性别决定机制为XX/XY型。 

图2.通过组织学切片对雌雄同体生殖腺进行性别鉴定，并对杂交种群进行正常繁殖。（A）为雌核发育群体的卵巢切片，所有个体均为雌性。（B）（C）正常雄性和雌性的卵巢和睾丸切片

2.2b-RAD测序数据分析及候选性别特异性标签筛选

为了在杂交鱼中找到性别特异性标签，作者使用2b-RAD测序对杂交鱼的10只雄性和10只雌性进行基因型分型。高测序覆盖率保证了本研究产生的性别特异性序列的高可靠性。利用性别相关SNPs (FDR＞4)构建的系统发育树品示，雌雄个体独立聚在一起，并分别分成两个大分支(图3)。结果表明，这些标记的可靠性和群体可用于性别特异性标记的筛选。

为了识别杂交鱼的性别特异性标签或SNPs，我们提取了这些性别特异性标签或SNPs，它们出现在一个性别的个体中而不是出现在其他性别的所有个体中。最后，在所有雄性个体中发现了9个特定的标签但是没有鉴定出雌性（表1），鉴定出30个snp与杂种群体性别显著相关(P<10-5)。在这些SNPs中，有5个SNPs在所有雄性中是杂合的，而在所有雌性中是纯合的(表2），进一步表明杂交种具有XX/XY性别判定系统。

图3.基于2b-RAD序列的性别相关SNPs构建系统发育树(FDR> 4)

表1. 九个候选雄性特定标签的信息

表2. 五个显著性相关SNPs的信息

3.侯选性别特异性标签和SNPS的验证

为了设计PCR扩增雄性特异性2b-RAD标签和SNPs的引物，我们从杂交雄性鱼基因组调查数据中获得了这些标签和SNPs的侧翼序列。根据序列，为每个候选性别特异性标签和SNP设计了三对引物。经PCR和Sanger测序验证，使用最佳引物成功扩增了九个候选雄性特异性标签中的两个（ref57033–1和ref57066–1），并且在所有雄性中成功扩增了性别特异性412 bp（ref57033–1）和326 bp（ref57660–1）片段，但在2b-RAD测序群体的雌性中未成功扩增（图4A和B）。此外，其他7个雄性特异性标签和5个性别特异性SNP被排除在外，因为它们可以从两性中部分扩增，或者在所有雄性个体中都没有扩增条带。因此，这两个标记及其引物可作为区分雌、雄个体的重要性别候选标记。

图4.两个候选雄性特异性2b-RAD标记物在三个不同群体中的验证。通过两对引物(ref57660-1-F/R、ref57033-1-F/R)的PCR扩增，在三个不同的群体中验证了两个雄性特异性标记(ref57660-1和ref57033-1），雄性特异性片段的扩增结果如图 (A) ~(F)所示。（A)和(B)表示2b-RAD测序种群，（C)和(D)表示另一个杂交种群，（E)和(F) 表示黑尾近红鲌种群

4.杂交群体与黑尾近红鲌的遗传性别

为了检测这两个雄性特异性标记的普遍性，使用候选雄性特异性2b-RAD标签的引物对另外30个杂交个体（15个雄性和15个雌性）进行性别鉴定。正如预期，在所有雄性动物中成功扩增了性别特异性412 bp（ref57660-1）和326 bp（ref57660-1）片段，但在雌性动物中没有扩增（图4C和D）。此外，考虑到杂交群体来源于雌性团头鲂和雄性黑尾近红鲌的杂交，雄性特异性标记可能是从父系那里遗传来的，因此我们推测它们也可能用于鉴别黑尾近红鲌体中的雄性。因此，我们选择了30个黑尾近红鲌个体（15只雄性和15只雌性）进行雄性特异性标记的验证，结果表明，性别特异性412 bp和326 bp片段也仅在雄性个体中成功扩增（图4E和F），这显然证实了作者假设。所有这些结果表明，获得了两个真实的雄性特异性标记（ref57660–1和ref57033–1），为大规模育种过程中的性别鉴定提供有效的参考。

5.转录组测序分析和转录水平验证的雄性特异性标记物

使用两个杂交组（雌性和雄性组）构建了六个性腺cDNA文库，并进行了质控。在单基因表达分析中，在雄性和雌性组之间共鉴定出21324个差异表达基因（DEG），与雌性组相比，雄性组中15299个DEG上调，6025个DEG下调（图5A）。其中，3122个DEG仅在雄性中表达，在雌性中不表达。为了进一步验证性别特异性标记的准确性，将两个雄性特异性标记映射到DEGs序列，ref57660–1（326bp）与Trinity DN17103 c2g1（770bp）成功匹配，后者仅在雄性中表达。结果表明，该单基因可能是一个雄特异性基因，参与性别分化。然后我们设计了特异性定量引物Trinity DN17103 F/R（701 bp），并验证其在雄性和雌性个体中的表达。结果表明，β-肌动蛋白的扩增带在雄性和雌性个体中都是稳定的，而靶带仅在所有雄性个体中存在（图5C），这进一步证实了2b-RAD分子标记的可靠性。

图5.雄性特异性分子标记的基因表达水平验证

文章结论 

本文是第一个结合2b-RAD和转录组测序方法筛选团头鲂♀×黑尾近红鲌♂杂交种的性别特异性标记研究。 首先，对杂种雌性进行人工诱导雌核发育，发现所有后代均为雌性。然后通过2b-RAD方法检测到两个雄性特异性标签，并通过PCR扩增在杂交种群和黑尾近红鲌种群中进行验证。此后，通过结合转录组测序和定量验证，从基因表达水平验证雄性特异性性别标记的可靠性。结合雌核发育群体中所有雌性的结果和已鉴定的雄性特异性标记，表明该杂交种为雌性同配子（XX），性别决定机制为XX/XY型。更重要的是，创造了一种利用雄性特异性标记通过PCR和琼脂糖电泳快速有效地确定杂交个体遗传性别的方法，这对于结合人工控制育种技术进行大规模单性育种具有重要价值。

参考文献 

[1]Zhang Si-Qi,Xiong Xue-Mei,Shi Rui-Hui,Luo Li-Fei,Wang Gui-Ying,Tang De-Wen,Li Qing,Gao Ze-Xia. Screening and characterization of sex-specific markers for the hybrid (Megalobrama amblycephala ♀ × Ancherythroculter nigrocauda ♂) based on 2b-RAD and transcriptome sequencing[J]. Aquaculture,2022,548(P2):

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