项目文章 | STTT：欧易生物助力发现m6A修饰在心脏功能障碍的作用

中文标题：m6A去甲基化酶FTO通过调节葡萄糖摄入和糖酵解减轻小鼠心脏功能障碍

研究对象：横向主动脉缩窄 (TAC) 处理的心力衰竭（HF）小鼠模型

组学技术: MeRIP-seq

主要内容 

2021年11月2日，复旦大学附属中山医院心内科葛均波院士和孙爱军教授为共同通讯在 Signal Transduction and Targeted Therapy （IF=18.187）在线发表题为“m6A demethylase FTO attenuates cardiac dysfunction by regulating glucose uptake and glycolysis in mice with pressure overload-induced heart failure”的论文，张倍健、蒋昊和吴剑为该文章共同第一作者。该研究在HF 小鼠模型中使用loss-of-function和gain-of-function方法系统探究了m6A去甲基化酶基因 FTO 在心脏代谢中的调节作用，首次报道了该基因在心脏功能发挥和结构重塑中的关键功能，特别是作用于葡萄糖代谢途径，揭示了m6A修饰在 HF 期间心脏代谢稳态中作用，表明 FTO 有潜力成为 HF 预防和治疗靶点。欧易生物在本研究中承担了甲基化 RNA 免疫沉淀测序 (MeRIP-seq) 实验及分析工作。

技术路线 

研究背景 

N6-甲基腺苷 (m6A) 是哺乳动物转录后 mRNA最常见的修饰，参与多种生物过程和疾病。然而，其在心力衰竭 (HF) 期间心脏能量代谢变化中的作用仍然未知。该研究探讨了m6A去甲基酶FTO在压力超负荷诱导的 HF 期间葡萄糖代谢中的作用。

研究内容 

1. TAC小鼠心脏组织m6A水平升高，在代谢特别是糖酵解相关基因中发生

甲基化 RNA 免疫沉淀测序 (MeRIP-seq) 用于绘制TAC小鼠心脏和对照心脏中转录组m6A修饰。TAC 中鉴定出的m6A峰的数量高于对照。与之前的报道一致，在 TAC 和对照心脏中，m6A峰在 3''-非翻译区域富集，且m6A峰的序列特征符合典型的 RGAAR（R = A 或 G）motif规律。

a: 小鼠心脏组织检测到的m6A peak数量

b: m6A peaks在全长mRNA序列结构中的分布

c: motif特征序列分析

GO分析显示TAC 后的m6A变化不是随机分布在整个基因组中，而是在某些 mRNA 类别中特异性增加，特别是在与代谢相关类别中。KEGG分析显示糖酵解通路显著富集，包括醛缩酶B（Aldob）、磷酸甘油酸变位酶2（Pgam2）、磷酸葡萄糖变位酶2（Pgm2）、磷酸丙糖异构酶（Tpi1）等5个糖酵解相关基因和二氢硫辛酰脱氢酶（Dld）。

d: GO富集分析显示m6A集中分布代谢相关基因

e: KEGG富集结果表示糖酵解通路基因富集发生了m6A修饰

2. TAC小鼠中FTO基因表达水平显著下调，可能是驱动m6A模式改变的关键

为了探索HF中m6A模式显著改变的关键驱动基因，对于m6A修饰酶相关基因表达水平进行分析。TAC处理后1、3和7天，m6A修饰相关酶基因表达几乎没有变化，但大多数m6A修饰酶基因表达水平在2周下降，在4周和8周进一步下降，其中FTO mRNA表达下降最显著，FTO蛋白表达水平也显著降低；为了验证FTO表达水平在HF患者是否有相似的规律，本研究分析了来自数据库的 13 颗衰竭心脏和 15 颗未衰竭心脏 (GDS2206)的表达谱，结果表明HF 患者也表现出 FTO 表达下调。这些数据结果表明FTO的下调可能是TAC小鼠心脏m6A水平增加的关键驱动因素。

f:  TAC小鼠术后8周FTO基因表达降低最为显著

g: TAC小鼠术后8周 FTO蛋白表达水平显著降低

3. Gain-of-function实验表明FTO过表达缓解TAC小鼠心脏功能障碍

为了明确 FTO 基因在HF 中的作用，通过 AAV9病毒载体过表达 FTO 进行gain-of-function实验。与 TAC 组相比，FTO 过表达显著降低了 m6A水平，并且在 TAC 后 4 周和 8 周显著减轻心脏功能障碍，左心室肥厚和扩大症状有所改善，在第 8 周，与 TAC 小鼠相比，TAC+aavFTO 小鼠显著改善了运动耐力。

j: HE, Masson, WGA三种方法对左心室进行染色，Masson三色染色检测纤维化。用WGA染色分析心肌肥厚

通过micro-PET/CT 在 TAC 小鼠中观察到葡萄糖摄取显著增加，TAC+aavFTO小鼠对18F-FDG的摄取进一步增加，透射电镜显示FTO过表达改善TAC观察到的线粒体结构紊乱，这些证据表明 FTO 过表达可改善 TAC 小鼠的心脏功能障碍。

k: 用micro-PET/CT对FTO过表达小鼠的心脏18F-FDG摄取成像。

h, i: 通过超声心动图测量射血分数EF和短轴缩短率FS表示左心室功能

4. Loss-of-function实验表明FTO敲降加剧TAC小鼠心脏功能障碍

FTO 敲降加剧了TAC小鼠心脏纤维化和心肌肥厚，并且降低葡萄糖摄取水平。透射电镜观察到TAC 小鼠的心肌细胞中线粒体基质电子密度低，嵴紊乱，空泡形成，通过 FTO 敲降后，这些线粒体进一步加剧结构紊乱。表明 FTO 敲降加剧了心脏功能障碍和结构重塑以及心脏线粒体结构变化，降低了心脏能量供应。

S.a: 透射电镜线粒体结构,3000×(上图)，8000×(中图)，15000 ×(下图)。

S.b: 线粒体数量受损的统计

5. 体外实验证明FTO敲降抑制心肌细胞糖酵解能力和ATP产生，进而影响心肌收缩功能

为了进一步评估 FTO 在体外环境的代谢调控作用，该研究在原代心肌细胞进行FTO敲降和处理实验。在血管紧张素 II（Ang II）刺激模拟了TAC 小鼠模型中的FTO下调的表达模式。通过细胞外酸化率监测实验结果表明 Ang II 刺激提高心肌细胞的糖酵解能力，而在该基础上进行FTO 敲降会显著抑制糖酵解能力。FTO敲降导致的糖酵解能力抑制造成了ATP的生产障碍，可能直接影响心肌收缩功能；因此，FTO 敲降抑制了心肌细胞中 Ang II 刺激后的糖酵解能力和 ATP 产生，导致收缩功能障碍加重。

o: 用Seahorse XF Analyzer分析体外分离培养心肌细胞的细胞外酸化率(ECARs)

p: 糖酵解功能对比       q: ATP产量对比

6. FTO作用于葡糖糖摄入和糖酵解过程机制探讨

KEGG 分析显示，TAC 小鼠心脏中有五个糖酵解相关基因的 m6A发生了改变，为了探究这些基因 m6A模式改变是否影响蛋白表达水平，在 FTO 敲降的 TAC 小鼠中检测蛋白质表达水平分析，结果发现 只有Pgam2 蛋白水平显著降低，MeRIP-qPCR实验结果验证了FTO敲降进一步上调了Pgam2的甲基化水平；为了探究Pgam2的表达水平和m6A修饰是如何被FTO所调控，进行了RNA pull-down assay实验，实验结果表明FTO与生物素标记的Pgam2 mRNA结合，通过mRNA lifetime assays表明FTO敲降加速了Pgam2的mRNA降解速率。这提示了去甲基化酶FTO结合Pgam2 mRNA分子改变m6A修饰，影响其分子稳定性，进而影响蛋白水平和糖酵解途径中的功能发挥。

r：m6A发生改变的5个糖酵解相关基因

s：5个糖酵解相关基因蛋白表达水平

t：MeRIP-qPCR检测Pgam2 m6A水平

u：监测Pgam2 mRNA在原代心肌细胞中转录抑制处理后的降解速率

为了进一步探究FTO影响心肌细胞葡萄糖摄入量的原因，作者分别对葡萄糖转运蛋白系列基因的m6A水平和基因表达水平进行分析，MeRIP-seq 显示葡萄糖转运蛋白 (GLUT) 蛋白相关基因的m6A修饰没有任何变化，但FTO 敲低降低了 TAC 小鼠 Glut4转录水平表达，且 GLUT4 和磷酸化 AKT（p-AKT）蛋白水平显著下调；此外，PGAM2、GLUT4 和 p-AKT 的表达水平在 FTO 过表达后上调，这些数据提示 FTO 可能通过调节 AKT-GLUT4 轴来调节葡萄糖摄取。

v: FTO敲低下调GULT2、p-Akt、Akt蛋白水平

a~d: FTO过表达上调PGAM2，激活AKT-GLUT4轴基因表达

文章小结 

该研究在HF 小鼠模型中使用loss-of-function和gain-of-function方法系统探究了m6A去甲基化酶基因 FTO 在心脏代谢中的调节作用，首次报道了该基因在心脏功能发挥和结构重塑中的关键功能，特别是作用于葡萄糖代谢途径，揭示了m6A修饰在 HF 期间心脏代谢稳态中作用，表明 FTO 有潜力成为 HF 预防和治疗靶点。

FTO调节葡萄糖摄取和糖酵解的理论模型

专业术语 

1. 肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)：N6-甲基腺苷(m6A)去甲基酶，以往的研究证实FTO可通过3’非翻译区域调节下游的m6A水平来影响肥胖。随着研究的不断深入，研究者们发现m6A甲基化这一表观遗传修饰能通过调控肿瘤基因、抑肿瘤基因的mRNA分子的表达水平调控肿瘤的发生发展。

2. 主动脉弓缩窄（Transverse aortic constriction, TAC)模型：是一个慢性心室肥大的最为常用疾病模型，可用于模拟高血压或室内压增高而引起的肥厚性心肌病，在临床前药物研究或基础医学、生物学研究中广泛应用。TAC手术后即刻诱发/启动心室肥厚的进程。

3. Angiotensin II ：一种血管收缩剂，是肾素/血管紧张素系统的主要生物活性肽。Angiotensin II human 在调节人类血压中起着核心作用， 刺激交感神经刺激，增加醛固酮生物合成和肾脏活动。

4. Extracellular Acidification Rate （产酸率，ECAR）：糖解作用所产生的丙酮酸（pyruvate）经过actate dehydrogenasw 反应产生乳酸（lactate），允许细胞在不消耗氧气的情况下快速产生ATP以满足能量需求，测量乳酸的氢离子可以说明无氧代谢的变化。

5. Seahorse XF 分析仪：测量多孔板中活细胞的耗氧率 (OCR) 和细胞外酸化率 (ECAR),以研究关键细胞功能,例如线粒体呼吸和糖酵解。

6. 18F-FDG：18氟代脱氧葡萄糖，影像学检查PET/CT最常用的显像剂

7. micro-PET/CT：小动物PET/CT成像系统

8. masson染色：显示胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色；

9. WGA染色：主要染细胞膜，呈现绿色；

10. MeRIP-qPCR：MeRIP实验后进行一个qPCR，目的是验证某个目标基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰水平。

11. RNA pull-down：检测与目的RNA结合的蛋白质，使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物，该复合物与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离；复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

12. Oligomycin：是一种ATP synthase抑制剂，作用于线粒体膜的耦合过程，抑制氧化磷酸化和所有ATP依赖性反应

原文链接 

https://doi.org/10.1038/s41392-021-00699-w

精彩回顾 

1. RNA甲基化研究 | m6A概述

2. m6A研究重大突破！Science揭示m6A修饰和染色质状态的关系

3. Nature | 影响因子40.1，且看m6A与HSPCs的相爱相杀

4. 项目文章 | Genome Biol.：MeRIP-seq揭示水稻与病毒互作过程中m6A修饰的动态变化