项目文章 | 代谢组在鱼类生长发育研究中的应用

2022-06-12 06:40:13, 小维武汉迈特维尔生物科技有限公司

基于代谢组学分析温度对欧洲舌齿鲈幼鱼生长发育的影响

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2021.01

发表单位：设施渔业教育部重点实验室（大连海洋大学）

2021年1月大连海洋大学刘鹰教授团队张志强为一作在Science of the Total Environment上在线发表了题为：” Metabolomics analysis of the effects of temperature on the growth and development of juvenile European seabass (Dicentrarchus labrax)”的研究论文。在这项研究中，使用基于超高效液相色谱-串联质谱的代谢组学研究了温度对欧洲舌齿鲈生长和发育的影响。

欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）是一种生长速度高、食物转化率相对较好的海洋硬骨鱼，广泛分布于整个地中海。据联合国粮食及农业组织统计，欧洲舌齿鲈的全球水产养殖产量从2007年的10.4万吨增加到2016年的19.1万吨。多项研究报告了温度胁迫对欧洲舌齿鲈生态生理反应、氧化胁迫、幼鱼行为、营养和饲料管理的影响。低温和高温同样有害，但人们对低温控制新陈代谢的生理机制的影响知之甚少。

1. 生理指标测定：低温抑制了欧洲舌齿鲈的生长，恢复最适温度后诱导鱼的部分补偿生长

在10℃、15℃和20℃下培养60天后，鱼的平均体重随温度增加（表 1）。T3-E组的鱼体重最高，其次是T1-E和T2-E组的鱼。三组之间的平均体重存在显著差异（p < 0.05）。与以往的研究相似，作者的研究肯定较低的饲料、摄食与较低温度有关，然后抑制了欧洲舌齿鲈的生长。培养温度从75d到137d升至20℃。经过62天的培养（表1），作者发现T1-S和T2-S组的鱼体重显著低于T3-S组（p < 0.05）。但T1-S和T2-S组之间没有显著差异。T1-S和T2-S组的SGR（特定增长率）远高于T3-S组。T1-S组鱼的SGR最大，其次是T2-S 组，并与T3-S组相比差异显著（p < 0.05）。结合获得的结果，作者得出结论，低温（10°C 和15°C）可以诱导鱼类的部分补偿。随着温度的升高，鱼的FR（摄食率）显著上调。然而，T1-E组中的鱼表现出较差的活力，并且经常停留在水箱底部。当温度调至20℃ 62天时，T1-S和T2-S组之间的FR没有显著差异，尽管两组的FR均显著大于T3-S组（p < 0.05)。T3-S组的FR明显低于T3-E组。随着鱼的生长，FR降低。

在10℃的温度下，T1-E组的FCE显著低于T2-E和T3-E组。在15℃时，T2-E和T3-E组之间的FCE（饲料转化率）没有显著差异（p < 0.05）。然而，在20℃时，T1-S组的FCE高于T2-S和T3-S 组。综上所述，这些发现表明，欧洲舌齿鲈响应低温胁迫的补偿性生长可能与FR和 FCE相关。它可能通过增加新陈代谢和饲料转化率来促进生长。

表1：实验期间欧洲舌齿鲈生理指标分析

早期是指实验前的适应期（第 0-15 天）。实验的中期是指第16-75天。TI-E、T2-E和T3-E分别代表第16-75天暴露于10、15和20℃水中的组。实验的结束阶段是指第76-137天。T1-S、T2-S和T3-S分别代表暴露于10–20℃、15–20℃ 和20–20℃温度的组。T0-Y，采样第 1 天（第 15 天）；T1-E、T2-E、T3-E，采样第2天（第75 天）；T1-S、T2-S、T3-S，采样第3天（第137天）。不同上标字母表示差异显著（p < 0.05），相同字母表示差异不显著（p > 0.05）。

2.基于UPLC-MS/MS的代谢物定性和定量分析：共检测到456种代谢物，PCA结果显示各组之间的代谢物谱存在明显差异

参考MetWare数据库，对欧洲舌齿鲈的42个肝脏样本（每个处理组随机选取7个样本）进行了UPLC-MS/MS代谢组学分析。生成总样品中检测到的代谢物的多峰图，其中不同颜色的色谱峰代表不同的代谢物。共检测到456种代谢物，包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、有机酸和脂质。进行PCA以探讨温度对肝脏代谢功能的影响。PCA结果显示亚组之间的代谢物谱存在明显差异，表明在不同温度下60天后肝功能的差异。暴露于最佳温度 (20℃) 62天后，实验组的肝脏代谢物谱也发生了变化。

众所周知，水温较低时食物摄入量和活动量会减少。在本研究中，T1-E组的SGR和FR在实验中期（第16-75天）显著低于T2-E和T3-E组（p < 0.05），而活动也减少了。在实验的最后阶段（第76-137天），T1-S、T2-S和T3-S组之间的生理状态指标SGR和FCE存在显著差异（p < 0.005）。鱼类重新建立能量平衡以维持内部环境以应对环境和物理干扰非常重要。

代谢物作为基因的下游产物，可以直接反映不同群体之间的表型差异，放大基因表达、转录和蛋白质水平的差异。值得注意的是，由于水温的波动，实验中期肝脏的代谢功能存在显著差异，影响了鱼类的代谢、生长和发育。

3.肝脏中的差异代谢物：实验中期，共鉴定出71种差异代谢物，实验末期各组间共有46种差异代谢物

在实验中期，采用OPLS-DA等方法对欧洲舌齿鲈肝脏中响应不同温度条件的差异代谢物进行鉴定（T1-EL vs. T2-EL、T1-EL vs. T3- EL，以及T2-EL vs. T3-EL）。在代谢组学中，R2Y度量描述了模型解释的变异百分比，而Q2度量描述了模型的预测能力。结果表明聚集性良好，组间差异明显（图1A、C和E）。对于T1-EL与T2-EL、T1-EL与T3-EL、T2-EL与T3-EL 的OPLS-DA，R2Y 值分别为0.992、0.992和0.981，而Q2值分别为0.536、0.764和0.714（分别为图1B、D和F），表明源自OPLS-DA的模型具有良好的拟合和高预测性，因此被认为适合后续数据分析。

根据OPLS-DA结果，进一步筛选和分类组间差异代谢物。将各组间差异代谢物水平的显著差异标准化并生成聚类热图。维恩图（图 2A）显示半胱胺是各组（T1-EL对T2-EL、T1-EL对T3-EL 和T2-EL对T3-EL）之间共有的差异代谢物。

根据维恩图，共鉴定出71种差异代谢物，证实了温度对欧洲舌齿鲈生长发育的影响。不同水温下各组的肝脏代谢物谱存在显著差异，核苷酸差异最大（36.7%），其次是有机酸和相关衍生物（25.4%）和脂质（23.9%）。对T1-EL与T3-EL、T1-EL与T2-EL、T2-EL与T3-EL组之间差异代谢物数量的分析表明，温差越大，代谢物的差异越大。T1-EL 和 T2-EL组之间有18种差异代谢物（16种上调和2种下调），T1-EL和T3-EL组之间有43种差异代谢物（32种上调和11种下调），T2-EL和T3-EL组之间有33个（上调15个，下调18个）。T1-E-L和T3-E-L组之间脂质和核苷酸代谢物的含量存在明显差异。总之，这些结果证实了温度对欧洲舌齿鲈肝脏中脂质和核苷酸的代谢有显著影响，这与解剖取样观察到的脂肪堆积一致。α-酮戊二酸是三羧酸循环（TCA）循环中的重要物质，在谷氨酸的合成和分解中起重要作用。谷氨酸是精氨酸、脯氨酸和谷胱甘肽的前体。因此，谷氨酸含量的变化可能反映了谷胱甘肽、精氨酸和脯氨酸代谢的变化。同时，在三个实验组的维恩图中，半胱胺被鉴定为重叠的差异代谢物。半胱胺可以通过抑制或减弱生长抑素的作用直接或间接刺激生长激素的释放，从而促进鱼类的生长发育。

同样对实验末期（T1-SL vs. T2-SL、T1-SL vs. T3-SL、T2-SL vs. T3-SL）各组肝脏样本代谢组学数据依次分析确定欧洲舌齿鲈肝脏中的差异代谢物。结果表明聚集性良好，组间区分明显。根据OPLS-DA结果，对组间差异代谢物进行筛选和分类。结果显示，对于T1-SL与T2-SL、T1-SL与T3-SL以及T2-SL与T3-SL，7和9、7和26以及4和6个代谢物呈上升和下调。实验末期数据的维恩图（图 2B）显示，对于T1-SL与T2-SL、T1-SL与T3-SL或T2-SL与 T3-SL没有重叠的差异代谢物。

根据维恩图的结果，实验末期各组间共有46种差异代谢物，表明暴露于低温62天后恢复至最适温度（20℃）继续对欧洲舌齿鲈肝脏代谢有影响。在实验的最后阶段，T1-SL与T3-SL亚组之间代谢物尿苷二磷酸 (UDP)-葡萄糖、肌苷5''-单磷酸、鸟苷单磷酸和L-甲状腺素显著增加，N-乙酰-5-羟色胺、肉桂酸、大麦碱、苯乙胺、犬尿氨酸、亚精胺、L-高半胱氨酸、D-高半胱氨酸、全反式13,14-二氢视黄醇、5 -氧代脯氨酸和半胱胺显著降低。T2-S-L与T3-S-L 的主要区别在于碳水化合物和氨基酸代谢的代谢物显著减少，其中包括尿苷、同型半胱氨酸和5-氧脯氨酸。对黑石斑鱼、铁饼鱼和金头鲷的研究表明，长期冷暴露对能量代谢、蛋氨酸循环、渗透调节、膜流动性和不同组织中的抗氧化防御有不同的影响。此外，黄姑鱼的代谢组学研究表明，急性低温胁迫可导致脂肪酸代谢产生的代谢物发生显著变化。

图1：实验中肝脏样本代谢组学数据的OPLS-DA评分图和模型验证图。(A和B) T1-E-L与T2-E-L的OPLS-DA得分图和模型验证图。(C和D) T1-E-L与T3-E-L的OPLS-DA得分图和模型验证图。

图2：实验中期和后期肝脏样品差异代谢物维恩图。(A) 实验中期T1-E-L与T2-E-L、T1-E-L与T3-E-L、T2-E-L与T3-E-L差异代谢物之间的关系。(B)实验末期T1-S-L与T2-S-L、T1-S-L与T3-S-L、T2-S-L与T3-S-L差异代谢物之间的关系。

4. 欧洲舌齿鲈肝脏中差异代谢物的代谢途径：低温胁迫对牛磺酸代谢、胆汁分泌、色氨酸代谢、嘧啶代谢和甲状腺素代谢均有影响

为了探索不同温度对肝脏代谢途径的影响，筛选出的差异代谢物与KEGG数据库中的代谢途径相关联。基于差异代谢物生成KEGG分类图和气泡图（图 3 A、B 和 C），以识别与温度相关的潜在生物标志物的代谢途径。T1-EL和T2-EL亚组之间差异代谢物的主要代谢途径是皮质醇合成和分泌、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、酪氨酸代谢、甲状腺激素合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、嘌呤代谢和胆汁分泌。T1-EL和T3-EL亚组差异代谢物的主要代谢途径是酪氨酸代谢、甲状腺激素合成、胆汁分泌、柠檬酸循环（TCA循环）、胆固醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢、HIF- 1信号通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、赖氨酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、cAMP信号通路和嘧啶代谢。T2-EL和T3-EL亚组差异代谢物的主要代谢途径是亚油酸代谢、胆汁分泌、胆固醇代谢、色氨酸代谢、TCA循环、嘌呤代谢、半乳糖代谢、酪氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢，皮质醇合成和分泌、苯丙氨酸代谢、组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及β-丙氨酸代谢。

一般来说，鱼类有两种策略通过新陈代谢的变化来适应寒冷的温度：（1）新陈代谢率的补偿性增加和（2）抑制新陈代谢以减少能量消耗。TCA循环提供呼吸变化期间终末氧化的还原当量，因为TCA循环活动的增加表明能量需求和代谢率升高。作者发现半胱胺素是实验后期牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径中最显著增加的代谢物。牛磺酸的摄入可能对细菌生物膜的结构产生重大影响，这会改变膜的流动性以及膜结合酶和转运蛋白的活性。

对选定的关注代谢物进行了通路相互作用分析。T1-E-L与T2-E-L、T1-E-L与T3-E-L以及T2-E-L与T3-E-L的差异代谢物途径的相互作用图分别如图4A、B和C所示。在T1-E-L与T2-E-L差异代谢物通路相互作用图中，所有差异代谢物都被上调。γ-谷氨酸和半胱氨酸位于相互作用图的中心，是谷胱甘肽代谢的重要代谢物。这些结果与低温对铁饼鱼和黄姑鱼代谢途径影响的结果一致。在T1-E-L与T3-E-L差异代谢物通路相互作用图中，位于图中心的5''-单磷酸腺苷被上调。腺苷5''-单磷酸参与嘌呤代谢和cGMP-PKG信号通路。肝脏中的嘌呤代谢与对温度应激的代谢反应密切相关。嘌呤天然存在于细胞环境中，在应对压力和损伤时在器官和组织中发挥保护作用。cGMP-PKG信号通路与类固醇激素有关，类固醇激素在脊椎动物的繁殖、发育和生长中起着非常重要的作用。T2-E-L与T3-E-L图中的棉子糖涉及半乳糖代谢。在应对低温胁迫时，可以通过调节半乳糖代谢来满足身体的能量需求。所有三组的不同代谢物通路相互作用图都涉及L-肌肽，L-肌肽是影响欧洲舌齿鲈肝脏代谢的组氨酸和β-丙氨酸的重要代谢物。氨基甲酰磷酸被鉴定为T1-EL与T3-EL和T1-EL与T2-EL的差异代谢物，参与精氨酸生物合成、嘧啶代谢、嘌呤代谢和氨基酸的生物合成，并具有对欧洲舌齿鲈的生长和发育有重要影响。

基于筛选出的肝脏中对温度波动产生的差异代谢物的代谢途径生成代谢途径图（图 5）。结果表明，低温胁迫影响了欧洲舌齿鲈肝脏中的胆汁分泌和牛磺酸、谷胱甘肽、嘧啶、半乳糖、尿素和甲状腺素的代谢。温度会影响欧洲舌齿鲈的新陈代谢和随后的生长发育。肝细胞分泌的胆汁是分解和摄取蛋白质以提供能量的重要物质。

同样对低温胁迫后恢复最佳温度的各组间筛选出的差异代谢物与KEGG数据库中的代谢途径相关联。基于差异代谢物生成KEGG分类图和气泡图（图 3D、E 和 F），以识别与温度相关的潜在生物标志物的代谢途径。T1-SL和T2-SL亚组差异代谢物的主要代谢途径为牛磺酸和亚牛磺酸代谢、胆汁分泌、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、蛋白质消化吸收、嘌呤代谢、酪氨酸代谢、甲状腺激素合成、脂肪酸生物合成和视黄醇代谢。T1-SL和T3-SL亚组差异代谢物的主要代谢途径是戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、半乳糖代谢、嘧啶代谢、胆汁分泌、视黄醇代谢、嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢和D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢。T2-S-L和T3-S-L亚组差异代谢物的主要代谢途径是氨基糖和核苷酸糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。参与蛋白质合成的T1-S和T2-S亚组之间的差异代谢物得到增强。在实验的最后阶段，观察到补偿性生长，这可能与蛋白质合成有关，因为生长依赖于蛋白质的积累。

对选定的关注代谢物进行了通路相互作用分析。T1-S-L与T2-S-L、T1-S-L与T3-S-L以及T2-S-L与T3-S-L的差异代谢物途径的相互作用图分别如图4D、E和F所示。在T1-S-L与T3-S-L差异代谢物通路相互作用图的中心，代谢物5''-单磷酸腺苷和L-甲状腺素被上调。这些代谢物参与嘌呤代谢、cGMP-PKG信号通路、酪氨酸代谢、胆汁分泌和甲状腺激素合成。结果表明，较低的温度 (10℃) 应激影响了欧洲舌齿鲈肝脏的代谢。后期恢复到最适宜温度（20℃）后，该组SGR最大（表1）并实现部分补偿。这些结果可能与肌苷5''-单磷酸和L-甲状腺素的差异代谢产物有关。L-甲状腺素所涉及的胆汁分泌可用于饲料蛋白质的分解和吸收，与两组FCE结果一致，促进欧洲舌齿鲈的生长。T1-S-L与T3-S-L和T2-S-L与T3-S-L的差异代谢物L-同型半胱氨酸和5-氧代脯氨酸的含量显著降低。涉及的主要代谢途径是半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。半胱胺可通过上调蛋白质合成和减少脂肪沉积来调节营养代谢促进生长，并能增加肠绒毛长度，促进小肠消化吸收，进而提高饲料利用率。

基于筛选出的与从低温到20℃转变相关的差异代谢物的代谢途径生成代谢途径图（图 5B）。结果表明，低温胁迫对牛磺酸代谢、胆汁分泌、色氨酸代谢、嘧啶代谢和甲状腺素代谢均有影响。低温胁迫后的代偿性生长可能是由于这些代谢过程的影响和随后的部分代偿性生长。

图3：实验中后期各组间不同代谢物的气泡图。气泡图中的横坐标代表富集因子，而纵坐标是通路的名称。点的更深红色表示富集更显著。斑点的大小代表富集的差异代谢物的数量。(A) T1-E-L与T2-E-L差异代谢物的气泡图。(B) T1-E-L与T3-E-L差异代谢物的气泡图。(C) T2-E-L与T3-E-L差异代谢物的气泡图 (D) T1-S-L与T2-S-L差异代谢物的气泡图。(E)T1-S-L与T3-S-L差异代谢物的气泡图。(F) T2-S-L与T3-S-L 差异代谢物的气泡图。

图4: 实验中后期各组间差异代谢物间的相互作用图。上调的代谢物用红色表示，下调的代谢物用绿色表示。实线表示正调控，虚线表示负调控。

图 5：肝脏的代谢途径图。(A)在不同温度(10℃、15℃和20℃）下肝脏中不同代谢物的通路图。(B)在低温(10℃和15℃)应激后，在最佳温度(20℃)下肝脏中差异代谢物的通路图。上调的代谢物用红色表示，下调的代谢物用蓝色表示。

低温胁迫促进了与生长调节相关的代谢物的显著变化，例如α-酮戊二酸、UDP-葡萄糖、肌苷 5''-单磷酸、胍乙酸、牛磺胆酸、半胱胺和 L-甲状腺素等。参与这些生物合成途径的代谢物作用于欧洲舌齿鲈的生长和发育。作者的研究结果不仅为有效培养欧洲舌齿鲈提供了理论基础和技术指导，而且有可能开发用于补偿生长的高性能饲料配方。