2022-06-10 17:03:27, 食品安全的守护者 山东美正生物科技有限公司
本应用参照GB/T 21317-2007,采用ASPE720全自动固相萃取仪结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)建立了猪肉中四环素的检测方法。样品经Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取,PolyPlus HLB-2小柱净化,Kinetex F5色谱柱分析,外标法进行定量。结果表明,当四环素类添加水平为10 μg/kg时,使用ASPE720全自动固相萃取仪净化,回收率均在75% ~ 100%,RSD小于15%,能够满足检测要求。
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1
ASPE720
全自动固相萃取仪
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2
前处理耗材
1、主要仪器设备
PerkinElmer QSight液相色谱串联质谱仪;
ASPE720全自动固相萃取仪。
2、试剂材料
甲醇、乙酸乙酯为色谱纯;
乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙酸铅为分析纯;
四环素类混合标准品:用水:乙腈 = 3:1的溶液稀释;
柠檬酸溶液:0.1 mol/L。称取21.01 g柠檬酸,用水溶解,定容至1000 mL。
磷酸氢二钠溶液:0.2 mol/L。称取28.41 g磷酸氢二钠用水溶解,定容至1000 mL。
Mcllvaine缓冲溶液:将1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液混合。
Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:0.1 mol/L。称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠放入1625 mL Mcllvaine缓冲溶液中,使其溶解,混匀后调节pH至4.0 ± 0.05。
甲醇 + 水(1 + 19 )溶液:取10 mL甲醇与190 mL水混合。
甲醇+乙酸乙酯(1 + 9)溶液:取20 mL甲醇与180 mL乙酸乙酯混合。
PolyPlus HLB-2小柱:150 mg / 6 mL,P/N:CSS0146。
1、样品提取
称取均质猪肉5 g,置于50 mL离心管内,分别用20 mL、15 mL、10 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液进行提取,每次涡旋混合1 min,冰水浴超声10 min三次,10℃,3000 r/min离心5 min,合并上清液,并定容至50 mL,混匀,10℃,5000 r/min离心10 min,移取10 mL上清液转移至固相萃取仪标配的上样管中待净化。
2、样品净化
将HLB-2小柱放置于全自动固相萃取仪的SPE柱支架上,再将标配收集管放置于收集架上,按照表2的指令设置方法,启动仪器,由仪器自动完成净化步骤。
注:淋洗指令后的常规样品指令目的为吹干SPE小柱。
3、后处理
将洗脱液于35℃下用氮气浓缩至干,用1 mL初始流动相定容,涡旋震荡1 min,过0.22 μm Nylon滤膜,LC-MS/MS待测。
色谱柱:Kinetex F5,2.6 µm,3.0 × 50 mm ;
流动相A:2 mM醋酸铵(含0.1%甲酸);
流动相B:甲醇;
柱 温:35℃;
进样量:5 µL;
梯度洗脱见下表。
离子源:ESI+;雾化气温度:220℃;电喷雾电压:4800 V;离子源温度:300℃;反吹气温度:100℃;质谱接口温度:250℃;采集方式:多反应监测(MRM)。
注:本实验中所有标准物质都以第一组离子对作为定量离子对。
图 1. 10 ng/mL四环素类混合标准工作溶液色谱图
图 2. 10 ng/mL四环素类基质混合标准工作溶液色谱图
图 3. 猪肉基质空白色谱图
图4. 10 μg/kg猪肉基质加标色谱图
本实验采用ASPE720全自动固相萃取仪建立了猪肉中四环素类的前处理方法,并结合LC-MS/MS对猪肉中四环素类的含量进行了测定。对于加标量为10 μg/kg的猪肉样品,回收率在75% ~ 100%之间,RSD小于15%,符合实验要求,且方法稳定,说明ASPE720全自动固相萃取仪适用于此实验操作。
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