Bioactive Materials：北大/南医大研究团队联合发现miRNA在黄韧带肥厚中的作用机制

腰椎管狭窄症（LSS）是全世界老年人中最常见的脊柱疾病之一。相对狭窄和绝对狭窄的患病率随年龄增长而增加，导致患者日常生活中的严重残疾，对生活质量产生负面影响。黄韧带肥厚（LFH）已被发现是关键的促成因素之一，然而，目前尚无有效的治疗手段缓解黄韧带肥厚。

近日，南京医科大学第一附属医院任永信教授及北京大学深圳医院黄永灿教授在《Bioactive Materials》(2021 IF:14.59)上在线发表题为"Amelioration of ligamentum flavum hypertrophy using umbilical cord mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles "的研究结果。该研究阐述了miR-146a-5p 和 miR-221- 3p在人黄韧带组织中的表达与黄韧带的厚度呈负相关。人脐带干细胞来源的外泌体（umbilical cord mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles, hUCMSC-EVs）在体内和体外实验中被证实显著治疗了纤维化进程，改善了黄韧带肥厚。在机制上，hUCMSC-EVs传递miR-146a-5p 和 miR-221-3p 至黄韧带细胞中，后两者靶向结合到 SMAD4 mRNA 的3''-UTR 区域，从而抑制TGF-β/SMAD4 信号通路, 缓解黄韧带肥厚。

为了研究 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 表达水平与 LF 厚度之间的相关性，我们测量了 MRI 扫描中的 LF 厚度，并使用 RT-qPCR 检测了 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 的表达.如图 1A 所示，具有代表性的 MRI 扫描证实，LF 厚度 > 5 mm 的 LFH 影响了大部分椎管并导致严重的脊髓压迫。然而，正常的 LF 并没有压迫脊髓，其厚度小于 5 mm。LFH 组的平均 LF 厚度为 6.565 ± 1.243 mm，远高于对照组 (3.021 ± 0.448 mm)。H&E和EVG染色结果显示，LFH组弹性纤维减少，胶原纤维增加。弹力纤维染成蓝黑色（EVG 染色）不均匀、碎裂、排列不规则、杂乱无章、部分缺失。相比之下，在对照组中，弹性纤维丰富且排列整齐，胶原纤维很少。LFH组弹性纤维与胶原纤维的比例显着高于对照组。此外，RT-qPCR结果显示，LFH组miR-146a-5p和miR-221-3p表达水平显着低于对照组。miR-146a-5p 和 miR-221-3p 表达水平与 LF 厚度呈负相关（图1）。

图1.MiR-146a-5p和miR-221-3p与人类的LF厚度呈负相关

我们使用 miRNA-seq 筛选 EV 中的 miRNA表达谱，选取表达最丰富的五个miRNA为候选目标，即 miR-21-5p、miR-146a-5p、miR-221-3p、miR-143-3p 和 let-7i-5p，约占总 miRNA 读数的 60.47%。接着利用RT-qPCR 检测结果表明 miR-221-3p 和 miR-146a-5p 表达水平在 hUCMSC 和 hUCMSC-EV 组中最高。

我们进一步测量了在 TGF-β1 和/或 hUCMSC-EV 作用的情况下 LF 细胞中这五种 miRNA 的表达水平，结果表明hUCMSC-EVs 治疗使 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 表达水平分别显着增加 5.22 倍和 8.32 倍，提示了我们miR-146a-5p 和 miR-221-3p 可能在 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞纤维化的治疗作用中起关键作用（图2）。

图2.miR-146a-5p和miR-221-3p在hUCMSC-EVs中富集

我们通过建立小鼠双足站立模型形成小鼠黄韧带肥厚及利用TGF-β1刺激小鼠LF细胞纤维化，利用CCK-8、RT-qPCR、WB、IF、IHC、H&E及EVG染色实验在体内和体外证明了hUCMSC-EVs 可抑制小鼠的 LFH ，改善小鼠 LF 细胞的纤维化（图3、4）。

图3.hUCMSC-EVs减轻LF细胞纤维化

图4.hUCMSCs及其EVs抑制双足站立小鼠中LFH

为了进一步研究 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 是否可以递送至 LF 细胞，我们使用GW4869（一种囊泡抑制剂）作用细胞，将 Cy5 标记的 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 转染到 hUCMSCs 中 24 小时。随后，使用transwell 培养皿将 LF 细胞与 hUCMSCs 共培养。共培养48小时后，使用 IF 染色检测 Cy5 阳性 LF。结果显示，对照组的荧光强度远高于 GW4869 组，这证实了 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 通过 EVs 从 hUCMSCs 转移到 LF 细胞中。

接着，我们在hUCMSCs中转染 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 抑制剂后，hUCMSC-EVs 中 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 的表达水平显着降低。在应用TGF-β1 和hUCMSC-EV 的情况下，利用 RT-qPCR、蛋白质印迹和 IF 分析纤维化标志物（Col-I、α-SMA 和 Col-III）的表达水平，结果表明 EVs 中 miR-146a-5p 和/或 miR-221-3p 的抑制部分或几乎完全降低了 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞的治疗效果纤维化。因此，这些数据证实了 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 在 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞纤维化的治疗作用中起关键作用（图5）。

图5. MiR-146a-5p和miR-221-3p可通过EV递送至LF细胞并改善TGF-β1诱导的纤维化

通过生物信息学分析、靶基因的预测，我们最终选定SMAD4为候选靶基因进行下一步验证。我们将2种miRNA的模拟物、抑制物及其相应的阴性对照转染到LF细胞中，通过RT-qPCR及WB的检测，表明了miR-146a-5p和miR-221-3p可以在LF细胞的转录后水平调节SMAD4的表达。我们利用荧光素酶报告基因实验证明了 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 直接靶向 LF 细胞中的 SMAD4。为了确定 SMAD4 在 hUCMSC-EV 介导的 LF 细胞纤维化中的作用，在应用TGF-β1 和hUCMSC-EV 的情况下，将过表达的 SMAD4 和对照载体质粒（对照载体）转染到 LF 细胞，利用 RT-qPCR、蛋白质印迹和 IF 分析纤维化标志物（Col-I、α-SMA 和 Col-III）的表达水平，结果表明SMAD4 过表达消除了 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞纤维化的治疗作用，因此，SMAD4 是 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 的靶标，并且 SMAD4 过表达可以阻断 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞纤维化的改善作用（图6）。

图6. hUCMSC-EVs 通过传递miR-146a-5p和miR-221-3p抑制TGF-β/SMAD4信号传导来改善 TGF-β1诱导的LF细胞纤维化

最后，为了确定 SMAD4 和 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 富集的 hUCMSC-EV 在小鼠LFH进展中的作用，将hUCMSC-EV 或 AAV2-SMAD4（吉凯基因） 注射到老鼠 LF中，利用 RT-qPCR、蛋白质印迹和 IF 分析纤维化标志物（Col-I、α-SMA 和 Col-III）的表达水平，结果表明，通过敲低EVs 中的 miR-146a-5p 或 miR-221-3p 的表达部分降低了 hUCMSC-EVs的治疗效果。而在SMAD4 过表达后，hUCMSC-EVs 对小鼠LFH 的治疗作用几乎被消除。因此，hUCMSC-EVs 通过传递miR-146a-5p 和 miR-221-3p ，从而抑制 TGF-β/SMAD4 信号传导改善小鼠 LFH（图7）。

图7. hUCMSC-EVs通过传递miR-146a-5p和 miR-221-3p，抑制TGF-β/SMAD4信号传导缓解双足站立小鼠黄韧带肥厚

该研究中使用的SMAD4基因敲除的病毒由吉凯基因提供，助力高效率特异性的基因敲除。

南京医科大学第一附属医院任永信教授和北京大学深圳医院黄永灿教授为论文的共同通讯作用，马成、齐鑫和魏易凡为论文的共同第一作者。