RMS1000微型共焦拉曼光谱仪在用SERS方法快速检测食源性微生物中的应用

食品微生物污染是全球范围内的一个重要公共卫生问题，因此迫切需要针对食源性微生物的快速、高效和安全的传感策略。近日，浙江工商学院食品科学与生物工程学院王彦波教授在Chemical Engineering Journal期刊上发表了一篇题为《Plasmonic microneedle arrays for rapid extraction, SERS detection, and inactivation of bacteria》的文章提出了一种利用SERS方法快速检测肉制品中大肠杆菌的方法。

图1：基于MN的SERS检测食品样本中的细菌（不按比例）。（A） SERS活性MN贴片的制备。（B） MN贴片上细菌的选择性捕获和SERS检测。

在这项工作中，课题组开发了一种等离子体微针（MN）阵列贴片，用于快速提取和表面增强拉曼光谱（SERS）检测细菌大肠杆菌（E.coli）。通过在微模具中交联[2-（甲基丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵（TMA）、丙烯酸2-羧乙酯（CAA）和甲基丙烯酸2-羟乙基酯（HEMA），制备了亲水性MN基质。

然后用臭氧处理获得的MN贴片，并用SERS活性金纳米爆米花（GNpops）包覆，这些纳米爆米花用针对大肠杆菌的特定适体修饰。所制备的等离激元MN贴片可在3分钟内从琼脂糖模拟物中提取大肠杆菌，并且能够进行MN SERS分析。

图2：H-MN的制备。A）化学交联H-MN的示意图。B不同投料比（TMA:CAA:HEMA）制备的MN贴片的力学性能。C）不同孵育时间MN贴片的膨胀率。D） MN贴片的数字图像。比例尺：25毫米。E）H-MN的SEM图像。比例尺：200微米（左），400纳米（右）。

利用上海如海光电的RMS1000微型拉曼光谱仪从琼脂糖模拟物中检测大肠杆菌的SERS过程中，发现715、960、1140、1270、1457和1585 cm^-1处的信号强度随着大肠杆菌含量的增加而显著增强（图3A）。在提取过程中，大肠杆菌会通过溶胀驱动的毛细管力向P-MN移动，并可被GNpop上的特定APT捕获。一旦细菌覆盖在P-MN上，细菌组分的拉曼信号就会大大增强。960和1457 cm^-1处拉曼信号的增加可能是由于大肠杆菌的C-N拉伸模式和CH2变形模式造成的。然而，值得注意的是，P-MN在这些拉曼位移处也观察到微弱信号，这表明MN基质可能会在这些峰值处的背景干扰。因此，建议仅将信号增量分配给捕获的大肠杆菌。对于715、1140和1585 cm^-1的特征峰，它们可能由大肠杆菌的腺嘌呤/鸟嘌呤环模式或C-O-C拉伸模式或Apt贡献。对于这些峰，信号增加可能是由于Apt的构象变化，这将使拉曼生色团更靠近热点。从这个意义上讲，建议使用1270 cm^-1处的信号作为大肠杆菌识别的主要特征峰，而715、960、1140、1457和1585 cm^-1处的峰值可以作为额外的参考。

经进一步研究发现1270 cm^-1处的信号强度与大肠杆菌含量的对数呈线性相关，范围为2.4×102至2.4×106 CFU/g（图3B）。标准曲线为y=72.14*x-86.31，R2=0.970。该方法的检测限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为143 CFU/g和211 CFU/g。

图3：琼脂糖模拟物中大肠杆菌的SERS检测。A）从含有不同数量大肠杆菌菌落的琼脂糖模拟物中提取后的MN SERS光谱。B）大肠杆菌浓度与拉曼信号的标准曲线（n=3）。

选取样品进行测试分析，大肠杆菌的提取和SERS检测与琼脂糖模拟物类似。插入和取出P-MN后，可以在羊肉样品表面观察到微孔阵列（图4A），表明P-MN具有足够的机械强度，可以插入到真正的羊肉样品中。进行组织学分析以研究PMN是否正确插入组织内。从图5B中可以看出，未插入的羊肉样品具有相对紧密的组织结构，而插入MN的样品呈现出由MN渗透引起的明显空洞。同时，P-MN在插入期间和插入后保持完整（图4C，图4D的图像），表明其具有足够的机械强度穿透羊肉样品。对于SERS分析，可以在羊肉样品的拉曼光谱中观察到大肠杆菌的特征峰（图4D）。根据新购买的羊肉样品的标准曲线反算的大肠杆菌含量为（2.55±1.25）×102 CFU/g，与平板计数法（2.00×102 CFU/g）的结果非常接近。这种差异可能是由于两种方法的采样位置不同。但总的来说，这两种方法显示的结果是相同数量级的。此外，它还与之前文献中报道的冷藏羊肉样品（1.60×102 CFU/g）表面的大肠杆菌含量相当。这些结果表明，基于MN的SERS检测在肉类等食品样品中细菌的实际检测中具有可靠的准确性和良好的适用性。

图5：真实羊肉样品中大肠杆菌的SERS检测。A） P-MN的羊肉渗透性（插入部位用台盼蓝染色）。B） 羊肉样品的苏木精-伊红（H&E）染色（下）和未插入MN（上）。C） 从羊肉样品中提取P-MN后的SEM图像，比例尺：200μm（左），400 nm（右）。D） 从新购买的冷藏羊肉样品中提取细菌后，进行了P-MN SERS光谱分析。

结语 

本文所提出的检测方法对大肠杆菌具有高度的特异性，可用于评估商业羊肉样品中的大肠杆菌污染。此外，通过光热灭菌可以有效地灭活提取的细菌。这项工作为简化微生物检测程序开辟了一条新途径，并通过SERS活性MN贴片提供了一种快速、现场微生物监测的潜在方法。

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