2022-05-19 20:18:29, 默克分析化学 默克生命科学
前言
罂粟壳又名“御米壳”,俗称“米壳”,为罂粟科植物罂粟的干燥成熟果壳,含有20多种生物碱,以吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁、蒂巴因5种异喹啉型生物碱为主。由于罂粟壳的易成瘾性,曾有报导一些不法商贩会将其加入火锅底料中,以达到吸引消费者的目的。消费者长期食用含有罂粟壳的食物,对人体肝脏、肾脏具有毒性损害作用,会使人成瘾、记忆性能衰退,严重可能对神经系统和消化系统造成损伤,甚至呼吸衰竭。鉴于此,我国早在2000年已经将罂粟壳归类为“其他毒品”,2008年,中国卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》,罂粟壳就被列为非食用物质,严格监管,禁止在食品中添加。
目前,罂粟壳生物碱的定量测定方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法。其中,气相和液相色谱法因复杂基质易产生假阳性,气相色谱法、气相色谱-质谱联用法样品需衍生化处理,超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS/MS)因选择性好、重复性好、灵敏度高应用愈来愈广泛。本应用采用QuEChERS方法进行预处理,并使用Ascentis® Express HILIC表面多孔色谱柱建立火锅底料中5种罂粟壳生物碱的UPLC-MS/MS分析方法,该方法稳定、高效,可准确定量上述五种生物碱,为调味料中非法添加物的测定提供借鉴。
样品前处理
称取2g试样于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中,加入60μL同位素内标(吗啡-D3、可待因-D3)工作溶液(5.0μg/mL),液体样品、半固体样品加入1-3mL水、固体样品加入5mL盐酸溶液。再分别涡旋振荡30s,准确加入15mL乙腈,密塞,涡旋振荡1min,超声处理30min,取出,加入Supel™ QuE乙酸提取管中的无机盐(55234-U),立即涡旋振荡2min,使吸附样品中的全部水分,以4000r/min离心5min,取上清液,以0.22μm滤膜过滤。取续滤液适量,进样,用于测定吗啡、可待因;准确量取续滤液1mL至20mL量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,进样,用于测定罂粟碱、那可丁、蒂巴因。
色谱/质谱条件
色谱/质谱参数
色谱柱
Ascentis® Express HILIC,
2 μm, 10 cm × 2.1 mm
(51409-U)
流动相
A: 甲酸乙腈溶液(0.1%)
B: 含0.1%甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液
梯度洗脱程序见下表
流速
300 μL/min
进样量
5.0 μL
柱温
35 ℃
离子源
ESI+
扫描方式
MRM
梯度洗脱程序
t/min
A (%)
B (%)
Initial
955
1.00
955
6.00
8515
6.50
6040
8.00
6040
8.10
955
12.00
955
扫描离子对
吗啡
286.0/181.3; 286.0/165.3
可待因
300.4/215.2; 300.4/165.4
罂粟碱
340.4/202.2;340.4/171.1
那可丁
414.4/220.5;414.4/353.3
蒂巴因
312.3/58.3;312.3/249.1
吗啡-D3
289.0/185.1;289.0/201.1
可待因-D3
303.0/215.2;303.0/165.2
实验谱图
图谱一:吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的标准品色谱图(10μg/L)
图谱二:火锅底料基质空白色谱图
图谱三:火锅底料基质加标样品色谱图
总结
吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱和蒂巴因均为极性较强的化合物,在常规C18色谱柱中保留较差。因此,本实验选用HILIC亲水模式加强5种化合物在色谱柱中的保留。此外,吗啡和可待因的分子结构式非常相似, 二者的差异仅在与苯环相连的1个基团 (羟基, 甲氧基) , 使用全多孔HILIC色谱柱分离时,吗啡和可待因无法完全达到基线分离.
而本实验中的Ascentis® Express HILIC表面多孔色谱柱 (填料结构如下图所示),由于其异于全多孔硅胶颗粒的结构,在相同的柱压条件下,柱效比同粒径全多孔颗粒高40%,因此吗啡和可待因可以得到有效分离。
表面多孔硅胶
填料结构
本实验对火锅底料样品进行方法确认。吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱和蒂巴因五种目标分析物标准品在0.01μg/ml~0.1μg/ml内取得了良好的线性关系(r2>0.995)。精密度及三个浓度点(0.02mg/kg, 0.04mg/kg, 0.08mg/kg)的加标回收率均满足实验要求。对流通市场抽取的火锅底料样品进行测定, 均未检出上述5种罂粟壳生物碱。
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