SCIENCE ADVANCES：用纳米内窥镜-AFM对活细胞内部成像

理解细胞内部结构的分子尺度动力学机制可以帮助人们更好的了解细胞的功能和疾病的相关机理。  然而，这种在活细胞内纳米动力学的直接成像对目前的各种成像技术来说依然一个巨大的挑战。比如说电子显微镜是一种在真空中对冰冻固定的细胞内结构进行成像，但无法在生理环境下用于活细胞的纳米动力学成像，仅限于固定构象的静态快照。虽然 人们现在依然在努力地发展环境电子显微镜的技术，希望能够在液体中观察未染色生物标本。但这种通过提高电子束强度来提高分辨率的方法可能会因为电子强度的过大使得样品变性。 另一种荧光显微技术虽说在活细胞中的蛋白质和细胞器上的成像越来越成熟和强大，但仍有基本的局限性。 理论上来说，它是对荧光探针的成像也不是对目标分子本身的像。 纳米尺度尤其是目标分子的大小、荧光探针及其连接物尺寸的大小到了到了一定程度时这种差异会变的不可忽略，即荧光方法不能很好的表示目标分子的位置和尺寸。此外因为染色效率的问题，荧光方法并不能完全对我们感兴趣的目标分子进行染色。细胞还会因为在多次长时间暴露于激光和高强度汞灯下产生光毒性，因此无法用荧光方法对所有的生物样品进行长时间的荧光观察。也正因如此人们对于开发新的无需依赖荧光染色而能在生理环境下对目标生物成像的技术的需求越来越强烈。

 日本金泽大学纳米生命科学研究所Takeshi Fukuma教授课题组在原子力显微镜（Atomic force microscopy,AFM）的基础上结合前人做过的一些研究开发出一种基于AFM力曲线的方法对细胞内的目标物进行3D或是2D的成像技术。作者先是用电镜中的FIB对商业化的AFM针尖（OPUS 3XG-GC, K=0.3N/M）刻蚀成如图1中的B图所示的长为十几个微米，宽约200nm,针尖的曲率半径在20nm以下的特殊的针尖。然后用这种特殊的针尖在HeLa细胞上一直往下压一直压到基底上，得到一个力-距离曲线（如图1中的C，D图），针尖的运行轨迹如图1中A图所示。借鉴于Bruker JPK 的QI（Quantitative Image^TM）的原理，力曲线中记录着完整的力和位置的信息，可以得到在针尖在某个作用力下的位移信息，从而重构出完整的三维结构图。作用利用自己编写的Labview软件对力曲线进行处理，就能重构出如图1中的G,H,I图中的三维高度图。为了证明这种针尖在成像过程中并不会对细胞产生很大的损害，作者用两种荧光染料对HeLa细胞进行细胞活性测试：一种是标记活细胞中细胞质的钙黄绿素am，另一种是对死细胞中细胞核进行标记的碘化丙啶(PI)。实验证明在这种针尖在对活细胞进行成像后并不会对细胞产生致命的损伤，细胞还是具有很好的活性。

作者还用这种纳米内窥镜-AFM的方法来对BALB / 3T3老鼠的成纤维细胞的肌动蛋白微丝在细胞内直接进行成像（如图2所示）。共聚集的荧光信号很好的印证了重构出的肌动蛋白微丝结构，以证明这种纳米内窥镜-AFM的方法可以非常有效的在生理环境下对活细胞内部结构进行原位重构成像。

除了能对细胞内三维结构的重构，作者进一步用这种方法对BALB / 3T3老鼠的成纤维细胞内部底层细胞膜的内膜直接进行2D形貌成像。为了能更好的防止细胞内骨架对针尖的污染，作者使用了轻敲模式且选用了针尖在细胞内的二倍共振频率进行驱动来做力曲线，并使用了更细的直径只有90nm长度十几个微米的针尖（这种针尖是无定型碳材质，通过电子束沉积的方式制成）来进行实验。然后对细胞内的底层膜进行实时成像，如图3中A图所示。这种方法还能扩展到对细胞内其实细胞器如细胞核的成像。

该工作使用了Bruker旗下的JPK Nanowizard®4三轴分立的闭环、全针尖扫描的生物型原子力显微镜。最新的JPK Nanowizard® V系统还配备了Bruker专利技术的 ,可以不用考虑针尖的动力学而非常轻易的成像。且还有专门针尖细胞成像的定量成像模式（QI）可以同时得到样品的表面形貌和机械性能的Mapping图。

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原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abj4990

Bruker NanoWizard®V 简介：

https://www.bruker.com/de/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-nanowizard-v-bioscience.html