恒光讲堂｜动态调节AIE分子非辐射和辐射衰减以实现光热治疗和免疫治疗

2022-03-25 05:00:16, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：作者通过设计CAT-NP纳米颗粒，利用其对氧化还原敏感型，使之在肿瘤细胞内逐渐解体，实现对AIE分子辐射衰减与非辐射衰减的动态调控，从而达到成像和NIR-Ⅱ介导的光热治疗与免疫治疗目的。

光热疗法(photoactivated photothermal therapy，PTT)已被证实是一种安全的肿瘤消融模型。常见的光热剂（如ICG、IR780）因为具有聚集诱导淬灭效应（aggregation-caused quenching，ACQ），辐射衰减受抑制，极大地限制了它们在癌症成像中的应用。然而，光热转换依赖于分子的非辐射衰减。聚合诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）技术可以很好地解决这一问题。AIE试剂在溶液中通过分子内运动导致的非辐射弛豫耗尽激发态能量。但当AIE分子聚集时，由于空间位阻，非辐射弛豫过程受到限制，使得S1的能量通过荧光途径到达S0。

光热治疗会诱导癌细胞发生免疫原性细胞死亡，将钙网蛋白、高迁移率族蛋白B1、ATP释放至细胞外，从而招募免疫细胞。然而CD39、CD73等胞外酶会使ATP转化为腺苷，并与免疫细胞的A2A受体（A2AR）结合以抑制其活性。因此为了进一步提高肿瘤免疫治疗疗效，CD39-CD73-A2AR通路抑制剂被研发，其中AZD4635被证明具有良好的安全性和治疗效果。

作者将TST、CPT-S-PEG、AZD4635通过共沉淀法合成纳米颗粒。其中TST为此先合成的AIE分子，CPS-S-PEG为喜树碱（CPT）与聚乙二醇（PEG）通过“-S-”连接的两亲型化合物。其治疗思路（图1）可简单概括为：喜树碱因含有多个共轭双键与TST有强烈的分子内相互作用，从而使TST的非辐射衰减受抑制，发射荧光；随着纳米颗粒被肿瘤细胞摄取，氧化还原敏感的“-S-”键断裂，纳米颗粒解体释放出TST，增强非辐射跃迁，加速光热转换；随着光热作用，肿瘤发生免疫原性细胞死亡,此前纳米颗粒释放出的AZD4635抑制CD39-CD73-A2AR通路，增强免疫疗效，同时喜树碱可以抑制DNA拓扑异构酶起到化疗作用。

图1：CAT-NP作用示意图

氧化还原敏感的CPT-S-PEG可被环境中高浓度的H2O2降解，导致纳米颗粒解体并释放TST。释放的TST解除了对非辐射衰减的抑制，因此CAT-NP的加热曲线与TST-Sol的加热曲线基本一致（图2 A，I）。图2 B显示CAT-NP的光热性能与激光功率有关。结果表明，CAT-NP的光热性质与其浓度有关。也就是说，纳米颗粒浓度越高，光热效率越高（图2 C）。此外，通过测量三个连续的加热和冷却循环，验证了CAT-NP的光热再现性（图2 D）如图2 E所示，CAT-NP为球形，粒径约为120nm，zeta电位约为−35 mV。图2 F、G证明了CAT-NP的荧光产率最高，其最强发射波长为1050nm。作者模拟肿瘤细胞的高过氧化氢氧化环境，研究CPT-S-PEG单键硫键断裂释放CPT的能力。结果表明，CPT的释放速率取决于环境中的H2O2浓度（图2 H）。在高过氧化氢环境中，CPT在4小时内几乎完全释放（92.4%），而在低过氧化氢环境中，CPT在24小时内仅释放45.6%。这证明了CPTS-PEG的氧化敏感性。

图2：CAT-NP光热性质表征

为了进一步探讨TST纳米颗粒的抗肿瘤作用，作者对4T1细胞系进行了一系列的初步研究。首先用MTT法研究了四种纳米颗粒在808 nm激光照射下的细胞毒性。结果表明，四种纳米粒子的细胞毒性呈浓度依赖性，即纳米粒子浓度越高，细胞毒性越强。不同之处是没有载TST的纳米颗粒(C-NP和CA-NP)，激光照射或不照射对其细胞毒性影响不大。然而，含有TST的纳米颗粒(CT-NP和CAT-NP)在激光照射后表现出更强的细胞毒性，尤其是CAT-NP，激光照射后对肿瘤细胞的杀伤作用最强(图3 A-D)。随后细胞摄取实验结果（图3 E，蓝色通道为Hoechst 33342标记的细胞核，绿色通道为phalloidine标记的细胞骨架，红色通道为亲脂性Cy5.5，红色强度代表细胞摄取Cy5.5的能力。）显示，纳米颗粒组的细胞吸收效率高于自由药物组。免疫印迹法研究了不同纳米颗粒的免疫原性细胞死亡和凋亡。结果（图3 G，CRT和HMGB1是ICD的标记蛋白，caspase 3是凋亡的标记蛋白）表明，CAT-NP引起的ICD和凋亡最严重，说明其抗肿瘤效果最好。凋亡检测试剂盒的实验也证明了这一点(图3 H)。

图3：体外抗肿瘤疗效评价

图4：TST纳米颗粒的体内成像

为了进一步探讨TST纳米颗粒的体内成像性能,当载瘤小鼠的肿瘤（AT1）长到100-200 mm3时进行 NIR-II成像（图4 A）、光热成像（图4 B）、光声成像（图4 C）。NIR-II成像可以看出，纳米颗粒组(DSPE-NP和CAT-NP)由于增强渗透性和滞留性(EPR)效应可以被动靶向到肿瘤，而TST-Sol不能在肿瘤部位富集。此外，TST-Sol在体内没有长期循环作用。光热成像证明了CAT-NP具有较好的光热性能，移植瘤的最高温度可达72°C。不仅如此，CAT-NP还表现出良好的光声成像。

为了进一步研究CPT、AZD4635和TST协同作用于癌细胞的潜在生物学机制，作者对不同处理的4T1细胞进行了全基因组RNA表达测序(RNA-seq)。然后，通过Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes 和 Genomes (KEGG) enrichment analysis分析，获得不同样品之间的生物学过程和通路差异。各组之间的基因表达关系由VENN图显示(图5)。

图5：不同纳米颗粒处理4T1细胞的基因测序

作者为了研究TST纳米颗粒在体内的抗肿瘤作用，将4T1-Luciferase细胞接种于Balb/c小鼠腋下皮下。当肿瘤达到100 mm3时，尾静脉注射不同的纳米颗粒。详细的实验方案如图6 A所示。图6 B、E是小鼠的肿瘤生长曲线的图形,显示CAT-NP仍显示最好的体内抗肿瘤作用。所有纳米修复体在体内均具有良好的安全性，未出现全身毒性所致的体重减轻，且心、肝、脾、肺、肾的病理切片均未发现异常根据小鼠的生存曲线(图6 D)，除DSPE-NP组和CAT-NP组外，其余各组小鼠在治疗开始后18天内死亡。治疗30 天后，CATNP组生存率为75%，DSPE-NP组为37.5%。在治疗后第0天、第4天、第8天、第12天直接观察肿瘤面积，图6 F表明，CAT-NP是最有效的治疗方法。然后对肿瘤组织病理切片进行H&E、TUNEL、Ki67免疫组化染色(图6 G)，CAT-NP引起的癌细胞凋亡和坏死最多。

由于AZD4635抑制腺苷生成，腺苷生成激活肿瘤免疫通路，因此采用流式细胞术检测肿瘤部位免疫细胞。如图7 A所示，CD3是总T淋巴细胞的标记蛋白，CD8是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的标记蛋白。图像中的圆圈表示CTL在肿瘤部位富集，CAT-NP组吸引到肿瘤部位的CTL数量最多(4.2%)，而盐水组(0.8%)。在图7 B中，CD11b和Gr-1阳性的细胞群均为MDSC, MDSC在整个细胞中的比例已用红色圈出。与生理盐水组(42.2%)相比，CAT-NP组MDSC的比例最小(27.1%)。结果表明，CAT-NP能最大限度地抑制MDSC的生成，最有效地激活免疫细胞的反应能力。然而，ATP通过CD39-CD73-A2AR途径转化为腺苷，抑制了免疫细胞活性(图7 C)。CAT-NP与光热治疗、化疗和免疫治疗的协同作用最佳(图7 E)。

综上所述，为了解决目前商用荧光染料在体内传递时易产生ACQ和浅层荧光穿透的问题，作者合成了一种兼具AIE和光热功能的新型NIR-II分子TST。通过设计CPT-S-PEG和AZD4635与TST共组装成纳米颗粒进行智能给药，进一步提高了TST的荧光产率和产热率，实现了良好的光热治疗、化疗和免疫治疗的协同效应。