Advanced Science：生物原子力显微镜分析肿瘤源性细胞外囊泡纳米力学性质及其与肿瘤恶性程度的相关性

肿瘤生物力学在肿瘤进展和转移中起着至关重要的作用。细胞在恶变过程中力学性质的改变引起细胞行为和肿瘤微环境的改变，最终决定肿瘤侵袭和转移。细胞外囊泡（EV）是细胞分泌的纳米级膜囊泡，携带和传递来源细胞的磷脂膜，及包浆蛋白和核酸等内容物，反映来源细胞的分子生物信息和力学性质，被认为是稳定循环的生物标志物。同时，EV参与细胞间通讯，在细胞外基质扩散，调节肿瘤微环境，广泛存在于循环系统中，其生物力学性质决定其在循环系统、肿瘤微环境以及细胞分泌和摄取等细胞间通讯过程中的行为，并最终影响肿瘤进展和转移。

目前对于癌症相关小细胞外囊泡（sEV）的研究基本是以杨氏模量作为评估指标，来表观地分析sEV的生物机械特性，但是没有深度剖析sEV内在的纳米力学性质，例如弯曲模量、渗透压和刚度等，也缺乏对这种封闭且包含其独特内容物的膜囊泡机械性质的考虑。

国家纳米科学中心杨延莲研究员课题组利用原子力显微镜设计纳米压痕实验探讨了sEV的力学性质，从而更好地理解sEV机械性质与细胞通讯功能之间的联系，并且通过建立一种新的力学模型对sEV的力学行为进行定量分析。相关工作(Quantitative Nanomechanical Analysis of Small Extracellular Vesicles for Tumor Malignancy Indication)于2021年8月2日发表在《Advanced Science》杂志上(DOI: 10.1002/advs.202100825)。

以乳腺癌为切入点，选取正常乳腺上皮细胞MCF-10A和不同乳腺癌细胞系来源的sEV建立模型体系，AFM形貌图显示吸附在基底上的sEV呈球形帽状形态，吸附的sEV几何形状由曲率半径和未变形sEV的高度比值决定，当其等于1时为半球形，小于1时为亚半球形，大于1时为超半球形。sEV平均比值随着源细胞恶性程度的增加而下降，这表明高度恶性的sEV在底物上变形更大，反映了高恶性sEV可能具有不同的纳米力学性能。

利用纳米压痕研究了sEV的纳米机械性能。在sEV的中心点进行连续压入，当施加力较小时，压入曲线和回撤曲线完全重叠，表明sEV的初始机械响应具有充分的弹性。随着力的增加，力曲线斜率降低，这可能是由于膜和尖端之间形成了向内的tether force。在平稳之后，sEV刚度突然增加，之后出现两个不连续的jump峰，可能对应于上下膜分别被穿透。当力进一步增加时，仅观察到一个jump峰，这可能是由于上下膜被推到一起并被针尖穿透所导致。经过连续压痕后sEV的高度和形状几乎保持不变，这表明sEV的脂质膜由于流动性和动态改变可以发生自我修复。

将MCF-10A分泌的sEV从0.5nN到3nN的力曲线做成密度散点分布图，发现在0.2个曲率半径的压痕范围内，sEV呈完全弹性行为，在此范围内计算sEV的刚度发现其随源细胞的恶性程度增加而增加，且随尺寸增加而降低。并且实验真实的刚度量级为10^-2表明sEV的真实刚度可能是由于膜内外的渗透压和弯曲模量共同决定。

归一化使渗透压和刚度无因次后，可以从两者中生成对数关系。将理论曲线的对数与实验值之间的欧几里德距离的平方和最小化以获得sEV的弯曲模量，在生成的关系中，弯曲模量是唯一未知的参数。计算出MCF-10A-sEV的弯曲模量为〜16κ_bT，且弯曲模量随源细胞恶性程度的增加而降低。这可能是因为不同来源的sEV中膜脂质和蛋白质具有其特异性。通过tether force和弯曲模量得到渗透压的值，发现渗透压随sEV的尺寸增加而降低，随源细胞的恶性而增加。当渗透压低时，弯曲模量占机械性质中的主导，当超过一定阈值时，渗透压占机械性质中的主导。

进一步进行了ROC分析以研究sEV的刚度，弯曲模量和渗透压在评估肿瘤恶性方面的效果。发现这三个因素在区分高恶性和正常细胞来源的sEV时均具有很高的敏感性和特异性。

该工作的AFM研究使用PeakForce Tapping技术结合力曲线分析在Dimension FastScanBio平台上完成。PeakForce Tapping技术有着杰出的力控制性能，可以在最小作用力下进行形貌表征，最大限度的保持样品原始的形貌，给出高分辨高质量的AFM形貌数据。相关力学测试可以通过Dimension ICON、Dimension FastScan以及NanoWizard系列原子力显微镜实现。