恒光讲堂｜用于近红外二区NIR-II光协同抗菌治疗的碳-铁纳米复合物

2022-01-06 20:27:52, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：由多重耐药细菌而引起的感染对人类健康仍然可以造成巨大威胁。因此我们需要探索更有效的抗菌替代策略。本研究开发了一种具有粗糙表面的碳-铁氧化物纳米复合物(RCF)，可用于近红外二区光协同抗菌治疗。RCF具有良好的光热特性和过氧化物酶样活性，可在NIR-II窗口下实现光热/动力协同治疗(PTT)。此外，表面粗糙的RCF可以增加细菌对其的粘附，更有利于协同抗菌作用。体外抗菌实验表明，RCF对革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均具可以产生杀伤作用。在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染大鼠的实验模型中，RCF可以清除感染菌，同时具有良好的生物相容性。本研究合成的抗菌药物RCF在治疗耐药细菌感染方面具有巨大潜力。

如图1所示，RCF可以催化低浓度的H2O2生成羟基。在低功率密度(0.5 W/cm2)的NIR-II窗口下，碳纳米壳还可以产生光热效应，因此复合物RCF具有协同抗菌能力。

图1：RCF纳米复合物的制备及其协同抗菌治疗的示意图。

首先，作者合成了碳纳米壳，平均直径为180 ± 20 nm（图2 a）。然后将其与Fe3O4纳米粒进行组装，组装后RCF表面变得粗糙，平均直径为190 ± 20 nm （图2 b-c）。接下来，作者验证了RCF的催化活性和光热性能。在测定其催化活性的实验中，当H2O2(10 mM)和TMB (1 mM)均存在时，RCF在652 nm处出现最强的吸收峰，这说明RCF具有类似过氧化物酶的性能，能够触发TMB的氧化，且这种催化活性与RCF浓度呈正相关（图2 g-h）。在测定其光热性能的实验中，作者用1064 nm波长激光照射RCF水溶液并记录下来其温度变化，发现不同浓度的RCF溶液的温度随着激光的照射均呈上升趋势，且也与浓度呈正相关（图2 i）。因此，RCF具有催化生成羟基和产生光热效应的特性，在抗感染治疗中具有很大的潜力。

图2： (a) RC， (b) RCF， (d) SC和(e) SCF纳米颗粒的TEM图像。 (c) RCF和(f) SCF纳米颗粒的SEM图片。比例尺:200nm。 (g)不同处理TMB溶液(1 mM)的紫外-可见吸收光谱。 (h) 不同RCF浓度处理的TMB溶液的紫外-可见吸收光谱。 (i)不同浓度RCF溶液经近红外激光后的光热曲线(1064 nm, 0.5 W/cm2，5 min)。

接下来，作者验证了RCF的体外抗菌效果。作者选取了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为参照菌，通过平板计数法，作者发现，当不添加H2O2同时也不加近红外二区光照时，RCF不能产生杀菌作用。当添加H2O2后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量均有明显下降，下降趋势与RCF浓度的升高呈正比。当加上近红外二区激光后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量也会明显下降，但无论是单独添加H2O2还是单独加近红外二区激光，其抗菌效果均不理想。但两个条件同时存在时，RCF均有良好的抗菌效力（图3a-d）。通过扫描电镜发现，当环境中同时存在RCF、H2O2和近红外二区激光存在时，RCF可以破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌结构，对其造成杀伤（图3e）。作者还发现RCF也可以对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生杀伤作用，最低抑菌浓度为256 μg/mL （图3f-g）。这些结果验证了RCF的高效协同抗菌作用。

图3：经近红外激光照射和H2O2处理的(a)大肠杆菌(b)金黄色葡萄球菌和(f)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的菌落。用平板计数法测定各组经RCF处理后大肠杆菌(c)、金黄色葡萄球菌(d)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (g)的细菌存活率。(e)不同处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的SEM图像:(I) PBS， (II) H2O2， (III) NIR， (IV) H2O2+ NIR， (V) RCF， (VI) RCF + H2O2， (VII) RCF + NIR， (VIII) RCF + H2O2+ NIR。比例尺:1 μm。

此外，作者还通过荧光染料STYO-9和PI分别染色活细菌和死细菌来验证RCF的杀菌效力。得到的结果与平板计数法的结果一致，表明RCF在协同抗菌治疗中具有巨大潜力（图4a-b）。

图4： (a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌经PBS、(II) H2O2、(III) NIR、(IV) H2O2+ NIR、(V) RCF (512 μg/mL)、(VI) RCF + H2O2、(VII) RCF + NIR、(VIII) RCF + H2O2+ NIR处理后的荧光图像。红色和绿色荧光分别代表死菌和活菌。比例尺: 25μm。

接下来，作者通过细胞毒性实验和溶血性实验探究了RCF的生物相容性。通过MTT法测定RCF在达到512 μg/mL时，L929细胞存活率仍大于80%（图5 a）。用PBS将RCF溶液稀释到不同浓度，分别与红细胞共孵育，各组均未发生溶血现象，表明其具有良好的生物相容性（图5 b）。在大鼠皮肤创面区域，照射1064 nm的激光（0.5 W/cm2）,在照射5 min后，创面区域温度从26.1℃迅速上升到60.4℃，证明RCF具有在体内PTT效应的可行性（图5 c-d）。

图5：(a)经不同浓度RCF溶液处理后L929细胞的细胞活力。 (b)不同浓度RCF溶液的相对溶血比。 (c) 256 μg RCF处理大鼠皮肤创伤后，在1064 nm, 0.5 W/cm2近红外激光照射5 min的热图像和温度变化曲线。

于是，作者为了验证RCF的体内清除感染菌的能力，选用了大鼠皮肤感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的动物模型。将同品系大鼠随机分为五组，Ⅰ.PBS组；Ⅱ.RCF组；Ⅲ.RCF + H2O2组；Ⅳ.RCF +NIR-II激光；Ⅴ.RCF + H2O2 + NIR-II激光。分别在处理后第1，3，5，7天对伤口进行图像采集（图6 a）。第7天时，对各组感染区域的组织载菌量和感染面积进行测定，并送去做组织切片，Ⅴ组结果与其他组相比有显著差异（图6 c-e）。综上，RCF具有良好的杀菌性能，有望用于抗菌感染和促进创面愈合。

图6：(a)在第0、1、3、5、7天采集不同处理组的感染伤口图像(I) PBS， (II) RCF， (III) RCF + H2O2， (IV) RCF + NIR， (V) RCF + H2O2+ NIR。(c)不同处理组的感染组织载菌量测定分析。 (d) 7 d后各治疗组的感染伤口面积。 (e) 7天后不同治疗组感染伤口组织的H&E染色图像。

结论：本研究成功构建了一种表面粗糙的碳铁氧化物纳米复合物来用于协同抗菌。碳纳米壳具有光热特性，同时氧化铁纳米粒具有类过氧化物酶催化活性，可以在NIR-II激光(1064 nm, 0.5 W/cm2)照射下，实现PTT/CDT的协同作用。此外，其具有良好的生物相容性和较低的毒性，为构建具有实际意义的高效抗菌新方法提供了一种简便的策略。

参考文献

Liu Z, ZhaoX, Yu B, Zhao N, Zhang C, Xu FJ. Rough Carbon-Iron Oxide Nanohybrids forNear-Infrared-II Light-Responsive Synergistic Antibacterial Therapy. ACSNano. 2021 Apr 27;15(4):7482-7490.

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