Kidney International | 溶血卵磷脂介导糖尿病肾病肾功能的快速衰退

糖尿病肾病（DKD）的全球发病率正在不断上升。一些DKD患者表现出肾功能快速降低，被称为“快速下降者”(FD)。因此，了解快速衰退的病理机制至关重要。在糖尿病患者中，除了血糖水平异常外，还经常观察到血脂异常，目前认为血脂异常会导致近端肾小管细胞损伤和DKD。也有研究表明脂代谢异常对DKD进展具有病理生理影响。近日来自日本东京大学的科研团队对DKD进行了全面的代谢组学分析，揭示溶血卵磷脂（LPC（16:0）和（18:0））可能介导DKD的快速进展，并可能成为新的治疗靶点，相关成果发表于《Kidney International》。

本研究使用来自COI-STREAM项目的133名G3期DKD亚洲患者的前瞻性队列，应用代谢组学方法鉴定与DKD快速进展相关的代谢物。其中10.5%的受试者（肾小球滤过率 (eGFR) 每年下降超过10%）被认为是FD患者。受试者的基线特征见表1。基线时血浆和尿液样本的代谢组学分析分别鉴定到260和198种已知代谢物。在这些代谢物中，血浆和尿液中的四种代谢物在FD和非FD组之间存在显著差异。将这四种代谢物与eGFR指标进行关联分析，结果显示尿液的四种代谢物中，只有LPC (16:0)与eGFR下降速度显著相关。因此，在随后实验中进一步分析了尿液中的LPC。

图1. 基线尿液LPC与DKD患者肾脏预后相关

LPC是与心血管疾病和糖尿病相关的生物活性脂质。对哺乳动物系统中的主要LPC种类（包括14:0、16:0、16:1、18:0、18:1、18:2、20:3、20:4、20:5和20:6）进行定量检测，并与内标进行比较，结果显示，PC (16:0) 和 (18:0) 在超过95%的DKD患者基线尿液中含量较高，而其他种类的LPC只在不到一半的受试者中检测到。在FD组尿液中，LPC（16:0）和LPC（18:0）浓度升高，并且LPC（16:0）和（18:0）均与2.5年后的eGFR下降率相关，但与基线时的eGFR无关。多元回归分析显示，eGFR 变化率与 LPC (16:0) 或 LPC (18:0) 显著相关，即使使用基线 eGFR 进行校正后依然相关。此外，LPC（16:0）和（18:0）与基线血清甘油三酯呈正相关，与基线血清高密度脂蛋白呈负相关。逻辑回归分析显示，基线时尿液中LPC（16:0）、（18:0）或两者的高浓度可以预测eGFR的快速下降。这些结果表明，尿液中LPC（16:0）和（18:0）可能介导DKD的快速进展。

图2. 基线尿液LPC（16:0）和（18:0）预测DKD患者肾功能快速下降的风险

随后对DKD大鼠模型中LPC种类是否发生等效变化进行研究：野生型（SD）、DKD（SD伴2型糖尿病：SDTF）和加速型DKD大鼠（单侧肾切除 SDTF：SDTF uNx）。SDTF大鼠表现出高血糖和血脂异常，尤其是总胆固醇和甘油三酯水平升高。在SDTF uNx大鼠中，肌酐清除率降低相关的肾损伤导致尿白蛋白与肌酐比率增加、肾小管损伤和肾脏重量增加，且这些改变比SDTF组严重。但是，SDTF uNx大鼠没有表现出加剧的高血糖症。与其他LPC种类相比，SDTF uNx大鼠尿液中LPC（16:0）和（18:0）水平升高，且LPC（16:0）和（18:0）与肌酐清除率呈负相关。综上所述，尿液LPC的升高（尤其是LPC（16:0）和（18:0））预示大鼠DKD进展迅速，与在DKD患者中的临床观察结果一致。

图3. SDTF加速DKD大鼠模型中尿液LPC水平升高

尽管尿液LPC (16:0)和(18:0)升高，但血液没有相应变化，表明尿液LPC (16:0)和(18:0) 变化源自肾脏脂质代谢异常。因此，随后对DKD大鼠模型肾组织中的LPC种类进行检测。结果显示SDTF uNx大鼠肾脏中LPC (16:0)和(18:0)均显著升高，且肾脏中这些LPC种类的水平与尿液中的水平显著相关。相反，与SDTF大鼠相比，SDTF uNx大鼠血浆或肝脏中这些LPC种类的水平没有显著升高。在SDTF uNx大鼠中，肾脏的LPC(16:0)和(18:0)组分占总LPC种类的比例(均超过30%)均高于血浆或肝组织。质谱成像分析显示，与SDTF或野生型SD大鼠相比，SDTF uNx大鼠肾小管间质区周围LPC(16:0)和(18:0)水平升高，而肾小球中这些LPC种类的水平在三组间没有变化。这些结果表明，SDTF uNx大鼠的尿液和肾脏中LPC(16:0)和(18:0)显著升高，这是由于局部肾脏代谢的改变而非全身性改变所致。

接下来对DKD大鼠肾组织中脂质代谢相关基因的表达水平进行检测。结果显示，在SDTF uNx大鼠中，分别负责正常低密度脂蛋白（LDL）和氧化LDL (ox-LDL)摄取的低密度脂蛋白受体(LDLR)和凝集素样氧化LDL受体-1 (LOX-1)的表达均显著上调。此外，在SDTF uNx大鼠中，对脂肪酸氧化(FAO)和维持脂质稳态很重要的线粒体β-氧化相关基因显著下调。同时，在SDTF uNx大鼠中，细胞内脂滴的主要成分perilipin 2 (PLIN2)显著上调。免疫组织染色显示皮质中肾小管上皮细胞中PLIN2的表达上调。这些结果表明，肾小管细胞对异常的脂质代谢（统称为“脂毒性”）非常敏感，可能介导DKD的快速进展。

图4. LPC (16:0)和(18:0)在SDTF uNx大鼠肾组织中异位积累

使用人肾小管近端上皮细胞（RPTEC）、原代培养的肾小管细胞和HK-2细胞（一种永生化的人近端肾小管细胞系），评估培养的近端肾小管细胞暴露于 LPC (16:0) 或 (18:0) 的效果，以探究肾脏中升高的 LPC 种类的病理生理学意义，结果显示，它们的结果一致。用LPC (16:0)或(18:0)处理培养的近端肾小管细胞显示出这些LPC种类在细胞内积累，但细胞内未检测到其他LPC种类的积累。而且，细胞内脂滴仅在用LPC（16:0）和（18:0）处理的细胞中显著积累。当用人ox-LDL或溶血磷脂酰基转移酶抑制剂（抑制LPC代谢）CI-976处理培养的近端肾小管细胞时，细胞内LPC（16:0）和（18:0）水平也升高。这些结果支持了这样的观点，即暴露于外源性LPC或ox-LDL，或改变LPC代谢，会导致LPC的细胞内积累和脂毒性，与加速DKD动物模型结果一致。

此外，培养的近端肾小管细胞暴露于LPC (16:0)或(18:0)以剂量依赖性方式引起严重的细胞毒性。两种LPC还增加了半胱天冬酶3/7活性并导致细胞凋亡的显著增强。LPC (16:0)或(18:0) 诱导的细胞溶质Ca²⁺水平增加可能有助于内质网 (ER) 应激介导的细胞凋亡。与未折叠蛋白反应相关的基因（如C/EBP同源蛋白（CHOP）、生长停滞和DNA损伤基因（GADD34）和内质网腔结合蛋白（BiP/ GRP78））的上调为LPC诱导内质网应激提供了证据。其中，LPC (16:0) 和(18:0) 结构相似，都结合长链饱和脂肪酸。LPC (16:0)和(18:0)表现出相似的病理生理作用，但LPC (18:0)效果更显著。因此，使用 LPC (18:0) 作为代表进一步研究 LPC 介导的脂毒性的分子机制。结果显示，LPC (18:0)处理激活了c-Jun N末端激酶(JNK)蛋白的磷酸化，该蛋白在ER应激反应的下游发挥作用。JNK的激活与Fas配体 (FASL)和harakiri (HRK)的上调相关，这两个都是JNK靶基因并激活促凋亡信号传导。总之，通过CHOP和HRK表达的增加证实了LPC(18:0)在RPTEC中诱导凋亡信号。

图5. 暴露于LPC导致细胞内积聚和细胞凋亡

考虑到HRK启动线粒体依赖性凋亡，且内质网应激与线粒体功能障碍有关，随后评估了细胞内LPC对肾小管细胞线粒体功能的影响。结果显示，LPC（18:0）处理以剂量依赖性方式增加线粒体活性氧（ROS）。由于担心永生化细胞中细胞代谢异常，因此对RPTEC细胞进行能量代谢研究，发现LPC（18:0）处理严重损害了培养的近端小管细胞中的线粒体耗氧率，同时降低了ATP产生及基础和最大呼吸速率，且线粒体膜通透性增加。此外，LPC（18:0）处理诱导培养的近端肾小管细胞中线粒体形态学发生变化，线粒体密度和长度发生改变，并观察到吞噬体增加。

图6. LPC (18:0) 诱导HK-2细胞线粒体损伤

最后，对高剂量（60μM：细胞毒性剂量）或低剂量（30μM：细胞毒性剂量）的LPC（18:0）处理培养的近端肾小管细胞进行微阵列分析。结果显示超过600个基因在两种剂量的LPC(18:0)处理后差异表达。值得注意的是，在高剂量和低剂量LPC处理组中，上调的前15个基因中包含了3个过氧化物酶增殖体激活受体（PPAR）靶基因，包括上调幅度最大的基因。通过检索KEGG中PPAR的靶基因，并核对其表达谱，发现与脂肪生成相关的基因（如血管生成素样4（ANGPTL4）和PLIN2）表达上调。且证实LPC（16:0）和（18:0）均以剂量依赖性方式上调ANGPTL4和PLIN2；这些作用被 PPARδ (PPARδ i) 的选择性拮抗剂 GSK0660 抑制，但不受 PPAR a/γ 拮抗剂 GW9662 的抑制（PPAR a/γ i）。而且，GSK0660（而非 GW9662）显著抑制了LPC诱导的促凋亡应激标记物（例如CHOP和HRK）的上调。此外，LPC直接激活 PPARδ的依赖性转录。

从表型角度来看，GSK0660还抑制LPC（18:0）诱导的细胞毒性和线粒体活性氧产生。由于上调基因与PPAR介导的脂肪生成有关，随后将重点放在LPC处理对PLIN2的异常激活上，因为PLIN2增强了脂滴的积累，并在SDTF uNx大鼠的肾小管中观察到PLIN2的异位激活。且证实GSK0660处理和PLIN2基因敲除均能减少LPC（18:0）诱导的脂滴积聚。接下来检测了自噬通量的变化（脂滴降解的一个重要机制）。用LPC（18:0）处理培养的近端肾小管细胞24小时可增加微管相关蛋白轻链3-II（LC3-II）的水平，而GSK0660的联合处理可显著抑制这种效应。通过比较氯喹（一种经典的自噬体降解抑制剂）存在和不存在时检测LC3-II的水平来获得自噬通量，结果显示，LPC (18:0)显著削弱了自噬通量，而GSK0660恢复了这种通量。总之，这些数据表明 PPARδ的激活有助于LPC诱导的肾小管细胞脂毒性。

图7. LPC诱导肾小管细胞PPARδ活化和脂质毒性

本研究通过对DKD患者前瞻性队列进行代谢组学分析，发现尿液中LPC(16:0)和(18:0)在FD发病机制中的重要作用。随后通过加速型DKD大鼠模型和体外细胞水平的实验，验证了LPC 在DKD的快速进展中的病理生理作用。阐明了DKD快速进展的发病机制并提出新的治疗靶点。

Lysophosphatidylcholine mediates fast decline in kidney function in diabetic kidney disease.  Kidney Int. 2021. 

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