国自然热点——自噬和铁死亡如何在肿瘤中各显身手？

自噬和铁死亡是近年来国自然研究的两大研究热点，深入研究其作用机理对肿瘤靶标发现具有重要意义和价值，因此小编通过此篇简要分享这两个研究热点的常用技术和研究思路，希望能够对大家有所帮助。

细胞自噬（autophagy）又称为II型程序性细胞死亡，是所有活细胞的核心功能之一，是细胞为了应对饥饿、应激等外界环境条件刺激下而出现的一种破坏蛋白质和细胞器而细胞膜不被破坏的一种自我调控过程。根据自噬发生的特征，自噬可分为大自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬。根据自噬发生所降解的底物不同，自噬又分为线粒体自噬、过氧化物酶体自噬、脂自噬和铁蛋白自噬。细胞发生自噬时，首先会形成单层或双层膜，逐渐发展形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，溶酶体利用自身的水解酶降解细胞中受损的大分子、细胞器，进而将物质循环利用，维持细胞的稳态。

许多自噬相关蛋白（如ATG）及其核心复合物如ULK1/2激酶核心复合物等参与自噬的起始、成核、延伸、成熟、融合和降解等过程。一般来说，生理性的自噬是细胞进行自我保护的一种机制，使细胞免受特定刺激条件的损伤，维持细胞的正常生理活动。物极必反，当细胞发生过度自噬时不但起不到保护目的，反而会引起细胞的过度损伤和死亡即自噬性死亡。

下图展示了巨自噬和线体体自噬发生的信号通路图。其中mTOR 激酶是细胞自噬的关键分子。饥饿条件下 AMPK 活化，mTOR 失活；活化的 AMPK 可以催化 ULK1的丝氨酸发生磷酸化从而促进自噬相关蛋白Beclin-1的表达；而在营养充足时，AMPK 失活，mTOR 可与 ULK1 第 757 位丝氨酸结合抑制 ULK1-AMPK 互作，使ULK1 的失活从而最终抑制自噬途径的发生。

（图片来自于CST）

透射电子显微镜：观察到自噬体的形态结构，是检测自噬体的金标准。发生自噬细胞器如高尔基体、线粒体会彭大；视野下细胞轮廓完整，胞内可见一个个由内质网形成的吞噬泡，此方法可以用来区别凋亡和坏死。

WB和IF：LC3是自噬体膜上标志性蛋白，存在于自噬发生的全部过程，持续定位在自噬体和自噬溶酶体，并最终在自噬溶酶体中降解。此外，相关的自噬标志物还有：ULK1、ATG14、ATG16、Nrf2、STAT3、P53等。

自噬流：红色和绿色荧光标记进行载体串联成 mRFP-GFP-LC3，随着自噬的发生，LC3带动 GFP 和 mRFP 荧光蛋白聚集在自噬相关的双层膜结构中，并在共聚焦显微镜下形成荧光点或者荧光斑。细胞中红色荧光点的数目代表自噬体和自噬溶酶体的总数量，绿色荧光点的数目代表自噬体的数量，两者的相对数量代表自噬流从自噬体到自噬溶酶体的流动速度，以此评价自噬流。

铁死亡（ferroptosis）是一种依赖于铁离子的积累而导致细胞出现脂质超氧化（ROS的聚集和多不饱和脂肪酸的消耗）新型细胞死亡形式，在形态、遗传、代谢等方面均不同于细胞凋亡、坏死、焦亡和自噬这些细胞死亡类型。细胞发生铁死亡时，形态上的变化有：线粒体体积减小、线粒体膜皱缩、嵴减少或消失、明显的线粒体膜电位增加，并没有染色质凝聚或质膜完整性丢失的现象；生化分子层面的表现主要有：细胞内的ROS升高，GSH下降等。

铁死亡被认为是肿瘤治疗的抑制靶通路之一，可以作为癌症治疗的新手段，其发生受严格而复杂的机制调控，主要调控机制有：

a. GPX4途径。GPX4是对抗细胞铁死亡的关键因子，是铁死亡的负控蛋白，同时也是铁死亡诱导剂Erastin、RSL等因子的关键靶点。GPX4是一种过氧化物分解酶，可将ROS降解，抑制铁死亡。所以，当GPX4酶活性受到抑制、表达减少都会破坏细胞氧化还原的平衡，引起ROS积累，诱发铁死亡；

b. 铁代谢。细胞内铁离子的含量受铁摄入和铁储存的严格调控，分别由转铁蛋白(transferrin, Tf)或转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1)介导进入细胞内，因此Tf或TfR1的表达抑制可显著抑制Erastin诱导的铁死亡过程；

c. CoQ10途径。CoQ是一种具有清除氧自由基的脂溶性抗氧化剂，能够调控细胞铁死亡的发生，且独立于GPX4信号通路发挥调节作用，且发现铁死亡抑制蛋白FSP1具有CoQ10氧化还原活性，因此可通过还原CoQ10抑制细胞铁死亡发生。

1. 抑制剂类：XC- 抑制因子，例如 Erastin 或其类似物、谷氨酸；GPX4 抑制剂，包括 RSL3、ML162；GPX4 清除剂，例如：FIN56、CoQ10；GPX4 活性抑制剂或是脂质过氧化激活剂， 如 FINO2。与铁死亡相关的抗癌药物类的抑制剂：索拉菲尼（抑制system xc-；激活p62-Keap1-NRF2通路）、柳氮磺胺吡啶（system xc-的有效抑制剂）、兰吡立松（与Erastin机制相似）、顺铂（与GSH结合，形成Pt-GS复合物）。

2. 细胞活力测定：CCK8 检测铁死亡抑制剂和干预因素一起处理后的细胞的活力回复实验，若死亡回复即可确认为铁死亡。

3. 脂质过氧化相关因子检测：ALOXs (包括 ALOX5，ALOX12，ALOX15B，ALOXE3，ALOX15，ALOX15B)，AKR1C1-3，ACSL4，ATP5G3。

多项研究结果表明铁死亡的发生需要自噬的参与，某些调控细胞自噬的因子如BECN1、Nrf2、STAT3、p53在铁死亡过程中也具有重要功能，如有研究结果说明铁死亡中ROS 的积累需要自噬的发生，且抑制自噬减弱了Erastin诱导的细胞ROS积累，从而提示诱导自噬依赖性铁死亡可能成为一种新型抗肿瘤的研究策略之一。

自噬参与调控的铁死亡途径主要有：自噬调节因子p53、BECN1、HSP90、Nrf2和STAT3可通过铁蛋白自噬、脂噬 、生物钟自噬 、CMA（分子伴侣HSP90介导的自噬）参与调控铁死亡过程。

其中BECN1由AMPK在Ser90/93/96位点磷酸化后，与System Xc-核心成分SLC7A11形成BECN1-SLC7A11复合物，从而直接抑制SystemXc-的活性，诱导铁死亡发生；STAT3是细胞铁死亡的正向调节因子，通过诱导组织蛋白酶B（cathespinB，CTSB)的表达、释放而增加细胞溶酶体膜的通透性导致溶酶体功能障碍，促进Erastin诱导的细胞铁死亡。

如图1所示，作者选取60种肿瘤细胞系，分别在溶酶体抑制剂氯喹CQ不存在或存在的情况下两种经典的铁死亡激活剂Erastin 和 RSL3对自噬相关标记物如MAP1LC3B 、SQSTM1或铁死亡标记物SLC7A11、GPX4在60种人类肿瘤细胞系中的表达变化，并发现在铁死亡诱导早期，MAP1LC3B-II、SLC7A11和GPX4之间的蛋白表达相关性较弱。

图1.MAP1LC3B-II、SQSTM1、GPX4和SLC7A11在癌细胞系中的蛋白表达图谱

作者将这些细胞分为两组：MAP1LC3BII–inducible cells (e.g., HT1080, PANC1, and 5637) 和MAP1LC3B-II–noninducible cells (e.g., BX-PC3, MCF-7,and NCI-H460)，结果发现，Erastin 或 RSL可以诱导MAP1LC3BII–inducible cells组细胞发生死亡（PI染色，如图2A）和脂质过氧化（2B），并且CQ可以抑制Erastin 或 RSL引起的细胞死亡，且下调自噬相关蛋白ATG5, ATG7, 或ATG4B后可抑制细胞死亡和脂质的过氧化（图2 D-E）。

图2.自噬在铁死亡中的作用

作者进一步检测了10个卵巢癌细胞系中MAPILC3B-II水平、细胞死亡和脂质过氧化之间是否存在正相关关系。结果表明，在Erastin或RSL3作用下，卵巢癌细胞株的细胞死亡和脂质过氧化水平与MAP1LC3B-II水平相当(图3A-E)。此外，CQ抑制了Erastin-或RSL3诱导的MAPILC3B-II诱导的卵巢癌细胞系(PEO4和SKOV3)的细胞死亡和脂质过氧化(图3A-E)，表明铁死亡依赖于细胞自噬。

图3.MAP1LC3BII诱导卵巢癌细胞系对铁死亡的敏感性

ATG5或ATG7的下调可逆转Erastin诱导的FTHI(铁蛋白重链1)的下调， FTHI是众所周知的自噬底物，通过储存铁而抑制铁死亡。但是研究发现在哺乳动物细胞中的关键胞内铁转运蛋白SLC40A1的蛋白表达也被Erastin所抑制，且Erastin诱导的SLC40A1蛋白下调被可被ATG5或ATG7的下调所回复，而其他铁代谢相关蛋白，如TERC(转铁蛋白受体)和STEAP3 (金属还原酶)不受ATG5或ATG7敲低的影响。

图4.体内实验结果表明下调SLC40A1可促进细胞铁死亡

注:IKE是一种体内代谢稳定性高的Erastin 类似物；Lip1是一种铁死亡抑制剂。

通过下调SLC40A1后的动物实验发现，在对照组和SLC40A1敲低细胞中(图4A -图4F)，下调SLC40A1或给药Lip-1并没有改变CASP3(凋亡标志物)的活性(图4G)。提示SLC40Al可能是铁死亡的抑制剂。由此可见，实时监测铁死亡中特异性自噬反应对于理解自噬-铁死亡的动态调节绝对是至关重要的。

更多关于细胞自噬和铁死亡的研究技术手段及其在肿瘤领域中的应用和研究价值，敬请关注近期讲座直播间。

【参考文献】

Jingbo Li. Tumor heterogeneity in autophagy-dependent ferroptosis. Cell Res.2016 Sep;26(9):1021-32.